中国中医科学院中药研究所在《Environmental Microbiome》期刊上(IF=7.9)发表了关于叶际真菌微生态网络的文章，该研究通过对ITS测序结果和环境因子测定结果以及皂苷含量测定结果进行生信分析，提出了维持微生态网络的稳定性策略和影响皂苷含量的因素。
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期刊： Environmental Microbiome
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影响因子： 7.9
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发表时间： 2023.07
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样本类型： 人参叶片
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DOI: 10.1186/s40793-023-00516-7
研究背景
叶际微生物群在植物的健康、生长和生物地球化学循环中起着至关重要的作用。但对叶际真菌群落的认识仍然缺乏，文章利用叶际真菌形成的复杂微生物生态网络(MENs：microbial ecological networks)在群落结构维持策略及其对植物次生代谢的贡献方面进一步展开研究，以便更全面地了解叶际生物圈及其在植物健康和生态中的作用。
文章亮点
本文研究了MENs中的模块及其与人参叶片中皂苷分布和总皂苷积累的联系，探索了可能促进三种人参皂苷积累的不同真菌群落之间的关系，为更好地了解植物-真菌相互作用的进化特征做贡献。
实验设计
在年平均气温为2.9~3.2℃的吉林省采样人参(PG：P. ginseng)和西洋参(PQ：P. quinquefolium)种子，并在云南（16.3~16.7°C）采集三七(PN：P. notoginseng)，将采集的三种人参种子进行规范化种植和管理。
图 三种人参的取样地点和相应的年平均温度
在3个种植2年、3年和4年生植物的人工林中，在每个人工林中3种人参各采集了90株健康植株。每种人参共采集270株植物。三种人参共810株。并测量环境因子数据和皂苷含量数据。
图 技术路线
实验结果
1、潜在的生物相互作用是真菌MENs连接的主要驱动因素
对样本进行二代ITS测序，选取相对丰度高于0.01%的真菌ASVs序列计算Spearman相关性，共构建关于3种植物2个隔室的6个网络，发现所有的MENs都以正连接为主(图1a)。进一步估计网络连接的潜在驱动因素，人参叶际真菌MENs之间的相互作用可能对现有连接贡献最大（图1b）。
图1 真菌MENs和不同驱动因素对网络连接的相对贡献
2、人参叶际真菌MENs稳定性高但效率低
为了探究真菌MENs维持稳态的原因，文章对确定性与随机性网络图的网络特性进行比较，并采用Zi -Pi框架观察节点分布，与随机网络相比，确定性网络有明显较低的全局效率和较高的avgL（边平均最短长度）(图2a-b)，而且确定性网络有明显更高的鲁棒性(图2c-d)。另外，在所有MENs中，只有少数节点确定为连接节点，并且没有节点被确定为网路中心节点(图2e)。表明人参叶际真菌MENs倾向于采用与中心无关的高鲁棒性策略，并牺牲网络效率来维持结构稳定。
图2 确定性与随机网络的网络特性比较以及Zi -Pi分析
3、网络模块有助于形成人参叶中的皂苷谱
计算了6个MENs中27个模块在5个及以上节点的模块属性（表示每个模块内所有ASVs相对丰度变化），分别对模块属性、环境因子与皂苷谱Sam变化进行Spearman相关分析，确定促进不同类型皂苷积累的候选模块（与皂苷变化显著正相关的模块为候选模块）和候选环境因子。将图2a、b、c的结果如表1所示。
| 候选模块 | 候选环境因子 | ||||||||||||
| PG | PQ | PN | PG | PQ | PN | ||||||||
| MENs | LE | LP | LE | LP | LE | LP | MENs | LE | LP | LE | LP | LE | LP |
| 候选 模块 | M1、M2 | M1、M2、M3 | M1、M3 | M1、M3 | M1、M5 | M1 | 候选环境因子 | OC、AK、NIN、MC和Ca | pH、AMN和MC | pH、AMN和MC | |||
表1 促进皂苷积累的候选模块和候选环境因子
为了评估真菌网络模块对人参叶片皂苷变化的贡献。用随机森林分析和k近邻回归两种机器学习算法各构建四个模型，用MSE（真实观测响应与预测响应之间的均方误差）和Spearman ρ评估模型性能。在两种机器算法中，包含候选真菌网络模块的模型表现更好(图3d-e)。
图3 真菌网络模块对叶片皂苷谱的贡献度
4、PRMs与人参之间存在更紧密的联系
与总皂苷含量呈正相关的ASVs数量超过一半的候选模块被确定为皂苷积累的正调节模块(PRMs)。皂苷积累的正调节模块(PRMs)比相同MEN中的其他模块节点的中心度更高（图4a），表明这些节点在群落结构中处于更中心的位置。此外，与其他节点相比，植物相关真菌群落（如植物病原体、内生菌等）在PRMs中的比例通常更高，这表明PRMs和人参之间的联系更紧密（图4b）。生态组装机制(NST)的研究也支持上图结论(图4c)。
图4 正向调节模块与其他网络成员在拓扑重要性、植物依赖因素和生态组装方面的比较
基于之前的模型，SEM可以评估PRMs在所有皂苷积累是否重要（图5a），χ2检验、CFI和RMSEA算法均适合三种人参叶际真菌网络模型(图5b-d)。PG中，LP中的M3对总皂苷含量有显著且直接的影响(图5b)。叶际真菌网络模块对总皂苷积累有直接的影响(图5c和d)。
图5 正调节模块（PRMs）对总皂苷影响的结构方程模型
5、特异且保守正调控类群有助于人参总皂苷积累
在SEM验证的正调控模块中，与总皂苷含量呈显著正相关的节点被确定为叶片皂苷积累正调控类群(PRT)。6个MENs富集分析表明，Pleosporales在三种人参物种的网络中都能观察到，而Chaetothyriales仅在PN的MENs中出现(图6a)。此外，几乎所有PG网络中的正调控类群（PRT）都与PQ和PN的PRT有亲缘关系(图6b)；在目水平上，PQ和PN分别具有明显的分类学特异性。总之，这些结果揭示了真菌分类群的特异性和保守性，这可能有助于叶总皂苷在三个人参物种中的积累。
图6 三种人参植物正调控微生物群的富集和分布图
研究结论
综上所述，本研究揭示了叶际真菌群落的高鲁棒性但低效率的网络特征，验证了网络模块对人参叶片皂苷谱和总皂苷含量的贡献。这些发现，为理解植物叶层菌群维持稳定的机制奠定了基础。
参考文献
Zhang GZ, et al. Modules in robust but low-efficiency phyllosphere fungal networks drive saponin accumulation in leaves of different Panax species. Environmental Microbiome.2023.
