下背痛（LBP）是导致老年人残疾的主要原因，而椎间盘退变（IDD）是导致下背痛的主要因素。铁死亡反应是一种新发现的程序性细胞死亡，其特点是依赖铁的致命脂质过氧化反应。越来越多的证据表明，铁死亡反应在各种人类疾病中发挥着重要作用。然而，IDD 中铁细胞凋亡的潜在机制仍然难以捉摸。本研究旨在全面揭示铁死亡在IDD发病和进展过程中的关键作用。
1. 确定与铁死亡相关的差异表达基因
首先，作者根据 GSE56081 数据集筛选出了 IDD 与对照组相比的差异表达基因（DGEs）。火山图显示共有 2269 个差异表达基因，包括 847 个下调基因和 1422 个上调基因（图 1A）。随后，作者将 IDD 中的 DGEs 与基于 FerrDb 数据库的铁死亡相关基因进行了交叉。如文氏图（图 1B）所示，共确定了 80 个铁变态反应相关差异表达基因（铁死亡差异基因）。分层聚类热图显示，IDD 组与对照组铁突变相关基因的表达有明显差异（图 2）。
图1 IDD 组和对照组之间差异表达基因的鉴定
图2 80个铁死亡相关差异表达基因（铁死亡差异基因）的分层聚类热图
2. 铁死亡差异基因的 GO 和 KEGG 功能分析
基因本体（Gene Ontology，GO）是一个国际标准化的基因功能分类系统，常用于对预测的基因功能进行分类。GO 主要分为三类：生物过程（BP）、细胞成分（CC）和分子功能（MF）。从生物过程的 GO 富集分析来看，这些铁死亡差异基因主要参与化学反应、应激反应和细胞对化学刺激的反应（图 3A）。如图 3B 所示，细胞组分的 GO 富集度最高的是内膜系统、囊泡和细胞外区域部分。在分子功能方面，这些铁死亡差异基因主要参与酶结合、过渡金属离子结合和氧化还原酶活性（图 3C）。然后，作者对这80个铁死亡差异基因进行了京都基因组百科全书（KEGG）分析。如图 3D所示，结果显示铁死亡差异基因主要参与了以下重要通路：铁死亡反应、TNF 信号通路、HIF-1 信号通路、NOD 样受体信号通路和 IL-17 信号通路等。
图3 铁死亡差异基因的功能富集分析
3. 铁死亡差异基因的PPI 分析
基于 STRING 数据库进行了 PPI 网络分析，并通过 Cytoscape 软件进行了可视化（图 4A）。然后，作者根据 PPI 得分确定了前十个关键铁死亡差异基因，包括 HMOX1、KEAP1、MAPK1、HSPA5、TXNRD1、IL6、PPARA、JUN、HIF1A 和 DUSP1，如图 4B 所示。在这些关键铁死亡差异基因中，KEAP1和IL6在IDD中下调，其余6个关键基因明显上调。这些关键基因大多对铁死亡有促进或抑制作用，而TXNRD1对铁凋亡的潜在作用尚不完全清楚。接下来，作者进行了皮尔逊相关分析，以评估这些关键铁死亡差异基因之间的关系（图 4C）。负相关最大的是 KEAP1-MAPK1，正相关最大的是 HSPA5-JUN、HSPA5-TXNRD1、HSPA5-DUSP1 和 DUSP1-JUN。HSPA5-JUN 对的相关性分析见图 4D，r 值为 0.99，p 值小于 0.01。KEAP1-MAPK1 对的相关性分析见图 4E，r 值为-0.93，p 值小于 0.01。
图4 铁死亡差异基因的PPI 分析
4. 关键铁死亡差异基因的功能分析
为了进一步研究前十位关键铁死亡差异基因的潜在分子功能，作者进行了功能和通路富集分析。在生物过程的GO富集分析中，这些关键铁死亡差异基因主要参与氧化应激反应、有毒物质反应、无机物质反应和细胞对氧化应激的反应（图5A）。在细胞成分类别中，最显著富集的GO项目包括核部分、洞穴、神经元投射胞质和质膜筏（图 5B）。在分子功能方面，铁死亡差异基因s 主要与转录因子结合、蛋白结构域特异性结合、酶结合和泛素蛋白连接酶结合有关（图 5C）。随后，作者对这十个关键基因进行了KEGG通路富集分析。如图 5D 所示，最有意义且显著富集的通路包括 Th17 细胞分化和 HIF-1 信号通路。
图5 关键铁死亡差异基因的功能分析
5. GSE124272 数据集中的关键铁死亡差异基因验证
为了评估这些关键 铁死亡差异基因 的预测价值，作者基于 GSE124272 数据集进行了 ROC 分析。ROC曲线显示，KEAP1、MAPK1、HSPA5、TXNRD1、JUN和HIF1A等6个关键基因的AUC值大于或等于0.70（图6A-J）。上述数据表明，这六个关键铁死亡差异基因 对 IDD 具有潜在的预测价值。
图6 基于 GSE124272 数据集验证这些关键铁死亡差异基因
6. 关键铁死亡差异基因在IDD细胞模型中的表达验证
为了进一步验证这些关键铁死亡差异基因在IDD中的表达，作者用TBHP处理大鼠盘状NP细胞，建立了IDD细胞模型。如图 7A 所示，TBHP 处理 24 h 后，大鼠 NP 细胞的活力明显受到抑制，且呈剂量依赖性。然后，作者通过 RT-qPCR 方法在 IDD 细胞模型中对这些关键铁死亡差异基因进行了验证实验。如图 7B-K 所示，TBHP 对关键铁死亡差异基因的 mRNA 表达水平有显著影响。与对照组相比，TBHP组HMOX1、KEAP1和HSPA5的表达水平下调，而TBHP组IL6和DUSP1的表达水平上调。
图7 在 IDD 细胞模型中验证这些关键铁死亡差异基因
总结
总之，本研究揭示了 IDD 中铁死亡相关基因的表达模式与对照组不同。作者确定了 80 个在 IDD 中表达失调的铁死亡差异基因。此外，作者还发现并验证了 10 个最重要的 OSRDEGs，包括 HMOX1、KEAP1、MAPK1、HSPA5、TXNRD1、IL6、PPARA、JUN、HIF1A 和 DUSP1。这些关键铁死亡差异基因与氧化应激和其他一些关键信号通路关系密切，深度参与了IDD的启动和发展。这些被发现的铁死亡差异基因可能是IDD的潜在标志基因。这项工作揭示了铁死亡可能为椎间盘退行性变的诊断和治疗提供一种新颖而有前景的策略。
