GATK Germline_SNP_INDEL_2.0 分析遗传病（耳聋）

news2024/11/26 0:46:04

GATK Germline_SNP_INDEL_2.0 分析遗传病（耳聋）

一、本文是Gatk Germline spns-indels Pipeline 分析遗传病(耳聋)的升级版，目的是提供开箱即用的分析流程，尽可能简化部署和迁移。

更新内容如下：

  • 人类参考基因组以及其他引用数据库文件版本由GRCh37（hg19）升级为GRCh38（hg38）

  • 数据注释软件annovar更换为Ensemble vep（108.2），Annovar需要商业授权，vep为apache2.0 licence，可以随意使用

  • Pipeline用到的软件由预先安装改为docker+conda首次使用时安装，初次运行初始化环境下载必要文件，迁移更方便

二、 流程概览图如下

流程概览

流程输入SRR9993255_R1.fastq.gz SRR9993255_R2.fastq.gz

测试数据下载
[SRX6732499: Targeted NGS of human: blood sample
1 ILLUMINA (Illumina HiSeq X Ten) run: 679,472 spots, 203.8M bases, 80.8Mb downloads

如果下载数据是sra，可以用NCBI官方工具sra-toolkit拆分成fastq.gz文件
fastq-dump SRR9993255 --split-3 --gzip
得到SRR9993255_R1.fastq.gz SRR9993255_R2.fastq.gz

分析流程文件（可一键导入sliverworkspace运行）及报告文件，conda环境文件下载，导入操作
运行环境docker image based on ubuntu21.04 Conda Mamba（默认使用清华源） ssh
分析软件- bwa=0.7.17
- sambamba=0.8.2
- samtools=1.16.1
- bedtools=2.30.0
- fastp=0.23.2
- gatk 4.3.0.0
- ensembl-vep=108.2
输出结果SRR9993255.result.qc.xls 数据质控结果
SRR9993255.result.variants.xls 突变结果文件

环境搭建: 为了快速完成环境搭建，节省95%以上时间。

本文使用docker + conda (mamba) 作为基础分析环境，镜像获取：docker/docker-compoes 的安装及镜像构建见《基于docker的生信基础环境镜像构建》,docker镜像基于ubuntu21.04构建，并安装有conda/mamba，ssh服务。并尝试初次运行时初始化安装所需软件下载所需文件（作为代价首次运行时间会较长，切需网络通畅），即实现自动初始化的分析流程。

备注：docker运行的操作系统，推荐为Linux，windows，macOS系统改下docker可能部分功能（网络）不能正常运行

# 拉取docker镜像
docker     pull     doujiangbaozi/sliverworkspace:latest

# 查看docker 镜像
docker     images

基础环境配置，docker-compose.yml 配置文件，可以根据需要自行修改调整

version: "3"
services:
  SarsCov2:
    image: doujiangbaozi/sliverworkspace:latest
    container_name: Germline
    volumes:
      - /media/sliver/Data/data:/opt/data:rw                               #挂载原始数据，放SC2目录下
      - /media/sliver/Manufacture/GL2/envs:/root/mambaforge-pypy3/envs:rw  #挂载envs conda环境目录
      - /media/sliver/Manufacture/GL2/config:/opt/config:rw                #挂载config conda配置文件目录
      - /media/sliver/Manufacture/GL2/ref:/opt/ref:rw                      #挂载reference目录
      - /media/sliver/Manufacture/GL2/result:/opt/result:rw                #挂载中间文件和输出结果目录
    ports:
      - "9024:9024"                                                        #ssh连接端口可以按需修改
    environment:
      - TZ=Asia/Shanghai                                                   #设置时区
      - PS=20191124                                                        #修改默认ssh密码
      - PT=2024                                                            #修改默认ssh连接端口

基础环境运行

# docker-compose.yml 所在目录下运行
docker-compose up -d

# 或者 
docker-compose up -d -f /路径/docker-compose.yaml

# 查看docker是否正常运行,docker-compose.yaml目录下运行
docker-compose ps

# 或者
docker ps

docker 容器使用，类似于登录远程服务器

# 登录docker，使用的是ssh服务，可以本地或者远程部署使用
ssh root@192.168.6.6 -p9024

# 看到如下，显示如下提示即正常登录
(base) root@SliverWorkstation:~#

三. 分析流程

  1. 变量设置：

    #样本编号
export sn=SRR9993255
#数据输入目录
export data=/opt/data
#数据输出、中间文件目录
export result=/opt/result
#conda安装的环境目录
export envs=/root/mambaforge-pypy3/envs
#vep cache 版本
export vep_version=108
#设置可用线程数
export threads=8
#与耳聋相关基因及突变文件
export whitelist=/opt/ref/whitelist.csv

  2. 数据过滤：

    #conda检测环境是否存在，首次运行不存在创建该环境并安装软件
if [ ! -d "${envs}/fastp" ]; then
  mamba env create -f /opt/config/fastp.yaml
fi

conda activate fastp

mkdir -p ${result}/${sn}/clean
mkdir -p ${result}/${sn}/qc

#使用默认参数
fastp \
	-w ${threads} \
	-i ${data}/Germline/${sn}_R1.fastq.gz \
	-I ${data}/Germline/${sn}_R2.fastq.gz \
	-o ${result}/${sn}/clean/${sn}_fastp_R1.fastq.gz \
	-O ${result}/${sn}/clean/${sn}_fastp_R2.fastq.gz \
	-j ${result}/${sn}/qc/${sn}_fastp.json \
	-h ${result}/${sn}/qc/${sn}_fastp.html

conda deactivate

  3. 数据比对、排序、标记重复；质控

    #conda检测环境是否存在，首次运行不存在创建该环境并安装软件
if [ ! -d "${envs}/align" ]; then
  mamba env create -f /opt/config/align.yaml
fi

conda activate align
#参考基因组文件如果不存在，去broadinstitute下载
if [ ! -f "/opt/ref/hg38/hg38.fasta" ]; then
	mkdir -p /opt/ref/hg38
	aria2c ftp://gsapubftp-anonymous@ftp.broadinstitute.org/bundle/hg38/Homo_sapiens_assembly38.fasta.gz -d /opt/ref/hg38 -o hg38.fasta.gz
	cd /opt/ref/hg38 && gzip -d /opt/ref/hg38/hg38.fasta.gz
	#如果索引文件不存在，创建索引
	if  [ ! -f /opt/ref/hg38.fasta.amb ] ||
		[ ! -f /opt/ref/hg38/hg38.fasta.ann ] ||
		[ ! -f /opt/ref/hg38/hg38.fasta.bwt ] ||
		[ ! -f /opt/ref/hg38/hg38.fasta.pac ] ||
    	[ ! -f /opt/ref/hg38/hg38.fasta.sa ]; then
    	bwa index /opt/ref/hg38/hg38.fasta
	fi
fi
#如果samtools索引不存在，创建
if [ ! -f "/opt/ref/hg38/hg38.fasta.fai" ]; then
	samtools faidx /opt/ref/hg38/hg38.fasta
fi

cd       ${result}
mkdir -p ${result}/${sn}/align
#数据比对、排序
bwa mem \
    -t ${threads} -M \
    -R "@RG\\tID:${sn}\\tLB:${sn}\\tPL:Illumina\\tPU:NextSeq550\\tSM:${sn}" \
    /opt/ref/hg38/hg38.fasta  \
    ${result}/${sn}/clean/${sn}_fastp_R1.fastq.gz \
    ${result}/${sn}/clean/${sn}_fastp_R2.fastq.gz \
    | sambamba view -S -f bam -l 0 /dev/stdin \
    | sambamba sort -t ${threads} -m 2G \
    	--tmpdir=${result}/${sn} \
        -o ${result}/${sn}/align/${sn}_sorted.bam /dev/stdin

ulimit -n 10240

#标记重复
sambamba  markdup \
	--tmpdir ${result}/${sn} \
	-t ${threads} \
    ${result}/${sn}/align/${sn}_sorted.bam \
    ${result}/${sn}/align/${sn}_marked.bam 
mv  ${result}/${sn}/align/${sn}_marked.bam.bai ${result}/${sn}/align/${sn}_marked.bai
rm  -f ${result}/${sn}/align/${sn}_sorted.bam

#数据文件没有附带bed文件，这里用bedtools反向计算一个
bedtools genomecov -ibam ${result}/${sn}/align/${sn}_marked.bam -bg > ${result}/${sn}/align/${sn}_bedtools.bed
bedtools merge     -i    ${result}/${sn}/align/${sn}_bedtools.bed   > ${result}/${sn}/align/${sn}_merged.bed

if [ ! -f "${envs}/bamdst/bamdst" ]; then
	apt-get update && apt-get install -y git make gcc zlib1g-dev
	git clone https://github.com/shiquan/bamdst.git "${envs}/bamdst"
	cd ${envs}/bamdst
	make
	cd ${result}
fi

${envs}/bamdst/bamdst -p ${result}/${sn}/align/${sn}_merged.bed -o ${result}/${sn}/qc --cutoffdepth 20 ${sn}/align/${sn}_marked.bam &
samtools flagstat --threads ${threads} ${result}/${sn}/align/${sn}_marked.bam > ${result}/${sn}/qc/${sn}_marked.flagstat &

wait

conda deactivate

  4. Gatk 获取碱基质量校准table

    #conda检测环境是否存在，首次运行不存在创建该环境并安装软件
if [ ! -f "${envs}/gatk/bin/gatk" ]; then
	mkdir -p ${envs}/gatk/bin
	#替代下载地址
	#https://github.com/broadinstitute/gatk/releases/download/4.3.0.0/gatk-4.3.0.0.zip
	aria2c https://download.yzuu.cf/broadinstitute/gatk/releases/download/4.3.0.0/gatk-4.3.0.0.zip -d ${envs}/gatk/bin -o gatk.zip
	apt-get install -y unzip
	cd ${envs}/gatk/bin 
	unzip -o gatk.zip 
	mv ${envs}/gatk/bin/gatk-4.3.0.0/* ${envs}/gatk/bin/
	rm -rf ${envs}/gatk/bin/gatk-4.3.0.0
	#chmod +x ${envs}/bin/gatk
	cd ${result}
fi

if [ ! -f "/opt/ref/hg38/dbsnp_146.hg38.vcf.gz" ]; then
	aria2c ftp://gsapubftp-anonymous@ftp.broadinstitute.org/bundle/hg38/dbsnp_146.hg38.vcf.gz -d /opt/ref/hg38
fi
if [ ! -f "/opt/ref/hg38/dbsnp_146.hg38.vcf.gz.tbi" ]; then
	aria2c ftp://gsapubftp-anonymous@ftp.broadinstitute.org/bundle/hg38/dbsnp_146.hg38.vcf.gz.tbi -d /opt/ref/hg38
fi
if [ ! -f "/opt/ref/hg38/Mills_and_1000G_gold_standard.indels.hg38.vcf.gz" ]; then
	aria2c ftp://gsapubftp-anonymous@ftp.broadinstitute.org/bundle/hg38/Mills_and_1000G_gold_standard.indels.hg38.vcf.gz -d /opt/ref/hg38
fi
if [ ! -f "/opt/ref/hg38/Mills_and_1000G_gold_standard.indels.hg38.vcf.gz.tbi" ]; then
	aria2c ftp://gsapubftp-anonymous@ftp.broadinstitute.org/bundle/hg38/Mills_and_1000G_gold_standard.indels.hg38.vcf.gz.tbi -d /opt/ref/hg38
fi
if [ ! -f "/opt/ref/hg38/1000G_phase1.snps.high_confidence.hg38.vcf.gz" ]; then
	aria2c ftp://gsapubftp-anonymous@ftp.broadinstitute.org/bundle/hg38/1000G_phase1.snps.high_confidence.hg38.vcf.gz -d /opt/ref/hg38
fi
if [ ! -f "/opt/ref/hg38/1000G_phase1.snps.high_confidence.hg38.vcf.gz.tbi" ]; then
	aria2c ftp://gsapubftp-anonymous@ftp.broadinstitute.org/bundle/hg38/1000G_phase1.snps.high_confidence.hg38.vcf.gz.tbi -d /opt/ref/hg38
fi


if [ ! -x "$(command -v python)" ]; then
	mamba env create -f ${envs}/gatk/bin/gatkcondaenv.yml
fi

if [ ! -x "$(command -v java)" ]; then
	mamba install -y openjdk=8.0.332
fi

conda activate gatk

if [ ! -f "/opt/ref/hg38/hg38.dict" ]; then
	gatk CreateSequenceDictionary -R /opt/ref/hg38/hg38.fasta -O /opt/ref/hg38/hg38.dict
fi

if [ ! -f "/opt/ref/hg38/hg38.exon.interval_list" ]; then
	gatk BedToIntervalList \
		-I /opt/ref/hg38/hg38.exon.bed \
		-SD /opt/ref/hg38/hg38.dict \
		-O /opt/ref/hg38/hg38.exon.interval_list
fi



gatk BaseRecalibrator \
	--known-sites /opt/ref/hg38/dbsnp_146.hg38.vcf.gz \
	--known-sites /opt/ref/hg38/Mills_and_1000G_gold_standard.indels.hg38.vcf.gz \
	--known-sites /opt/ref/hg38/1000G_phase1.snps.high_confidence.hg38.vcf.gz \
	-L /opt/ref/hg38/hg38.exon.interval_list \
	-R /opt/ref/hg38/hg38.fasta \
	-I ${result}/${sn}/align/${sn}_marked.bam \
	-O ${result}/${sn}/align/${sn}_recal.table

conda deactivate

  5. Gatk 应用碱基校准、获取insert size 统计信息

    conda activate gatk

gatk ApplyBQSR \
    --bqsr-recal-file ${result}/${sn}/align/${sn}_recal.table \
    -L /opt/ref/hg38/hg38.exon.interval_list \
    -R /opt/ref/hg38/hg38.fasta \
    -I ${result}/${sn}/align/${sn}_marked.bam \
    -O ${result}/${sn}/align/${sn}_bqsr.bam &

gatk CollectInsertSizeMetrics \
  -I ${result}/${sn}/align/${sn}_marked.bam \
  -O ${result}/${sn}/qc/${sn}_insertsize_metrics.txt \
  -H ${result}/${sn}/qc/${sn}_insertsize_histogram.pdf &

wait

conda deactivate

  6. Gatk HaplotypeCaller 获取snp/indel突变:

    conda activate gatk

mkdir -p ${result}/${sn}/vcf

gatk HaplotypeCaller \
    -R /opt/ref/hg38/hg38.fasta \
    -L /opt/ref/hg38/hg38.exon.interval_list \
    -I ${result}/${sn}/align/${sn}_bqsr.bam \
    -D /opt/ref/hg38/dbsnp_146.hg38.vcf.gz \
    -O ${result}/${sn}/vcf/${sn}.vcf
	
conda deactivate

  7. 单个样本数据不够运行VQSR，直接执行硬过滤，过滤参考数值见#https://gatk.broadinstitute.org/hc/en-us/articles/360035532412?id=11097

conda activate gatk
#https://gatk.broadinstitute.org/hc/en-us/articles/360035532412?id=11097
gatk VariantFiltration \
    -R /opt/ref/hg38/hg38.fasta \
    -V ${result}/${sn}/vcf/${sn}.vcf \
    -O ${result}/${sn}/vcf/${sn}_snp.vcf \
    --filter-name "SNP_DQ" \
    --filter-expression "DQ < 2.0" \
    --filter-name "SNP_MQ" \
    --filter-expression "MQ <40.0" \
    --filter-name "SNP_FS" \
    --filter-expression "FS > 60.0" \
    --filter-name "SNP_SOR" \
    --filter-expression "SOR > 3.0" \
    --filter-name "SNP_MQRankSum" \
    --filter-expression "MQRankSum < -12.5" \
    --filter-name "SNP_ReadPosRankSum" \
    --filter-expression "ReadPosRankSum < -8.0"

gatk VariantFiltration \
    -R /opt/ref/hg38/hg38.fasta \
    -V ${result}/${sn}/vcf/${sn}_snp.vcf \
    -O ${result}/${sn}/vcf/${sn}_filtered.vcf \
    --filter-name "INDEL_DQ" \
    --filter-expression "DQ < 2.0" \
    --filter-name "INDEL_FS" \
    --filter-expression "FS > 200.0" \
    --filter-name "INDEL_SOR" \
    --filter-expression "SOR > 10.0" \
    --filter-name "INDEL_ReadPosRankSum" \
    --filter-expression "ReadPosRankSum < -20.0" \
    --filter-name "INDEL_InbreedingCoeff" \
    --filter-expression "InbreedingCoeff < -0.8"
	
conda deactivate
  1. 使用vep注释突变结果:
#conda检测环境是否存在，首次运行不存在创建该环境并安装软件
if [ ! -d "${envs}/vep" ]; then
	mamba env create -f /opt/config/vep.yaml
fi

mkdir -p /opt/result/${sn}/vcf

if [ ! -d "/opt/ref/vep-cache/homo_sapiens/${vep_version}_GRCh38" ]; then
	aria2c https://ftp.ensembl.org/pub/release-${vep_version}/variation/indexed_vep_cache/homo_sapiens_vep_${vep_version}_GRCh38.tar.gz -d /opt/ref/
	tar -zxvf /opt/ref/homo_sapiens_vep_${vep_version}_GRCh38.tar.gz -C /opt/ref/vep-cache/
fi

conda activate vep

vep \
  -i /opt/result/${sn}/vcf/${sn}_filtered.vcf  \
  -o /opt/result/${sn}/vcf/${sn}_filtered_vep.xls \
  --offline \
  --cache \
  --cache_version ${vep_version} \
  --everything \
  --dir_cache /opt/ref/vep-cache \
  --dir_plugins /opt/ref/vep-cache/Plugins \
  --species homo_sapiens \
  --assembly GRCh38 \
  --hgvs \
  --fasta /opt/ref/hg38/hg38.fasta \
  --force_overwrite \
  --format vcf \
  --tab \
  --fork 8 \
  --offline

conda deactivate

  1. 编写脚本匹配whitelist基因，突变过滤后vcf文件，vep注释后的文件，得到最终结果

    #需借用gatk环境中的python来运行
conda activate gatk 

python ${envs}/GermlineVepAnnotationUtil.py \
	--whitelist=${whitelist} \
	-v ${result}/${sn}/vcf/${sn}_filtered.vcf \
	-a ${result}/${sn}/vcf/${sn}_filtered_vep.xls \
	-o ${result}/${sn}/${sn}.result.variants.xls

conda deactivate

  2. 编写脚本从fastp、bamdst、gatk CollectInsertSize 输出获取数据质控信息

    conda activate gatk

python ${envs}/GermlineQcUtil.py \
	--out=/opt/result/${sn}/${sn}.result.qc.xls \
	--sample-fastp=/opt/result/${sn}/qc/${sn}_fastp.json  \
	--sample-bamdst=/opt/result/${sn}/qc/coverage.report \
	--sample-insertsize=/opt/result/${sn}/qc/${sn}_insertsize_metrics.txt

conda deactivate

  3. 结果确认，IGV bam文件和突变位置：

    IGV

  4. 输出报告（报告模板见流程压缩包）:

    在这里插入图片描述

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Nginx负载均衡&#xff0c;反向代理入门配置&#xff1a; nginx.conf整体结构 nginx入门基本配置 Nginx.conf配置文件详解&#xff08;upstream和location负载均衡和反向代理配置&#xff09;&#xff1a; #运行用户 user www-data; #启动进程,通常设置成和cpu的数量相等 wor…
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基于边缘智能网关打造智慧体育场

基于边缘智能网关打造智慧体育场

运动健身是民众广泛存在的生活需求&#xff0c;体育场馆作为承载各种体育运动的基础设施&#xff0c;其运营管理效率、服务水平和智能化场景应用等都与用户体验紧密相关。 得益于物联网、边缘计算、AI智能等新技术的广泛应用&#xff0c;当前已有越来越多体育场馆通过部署基于…
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数据结构与算法——Java实现稀疏数组和队列

数据结构与算法——Java实现稀疏数组和队列

目录 一、基本介绍 1.1 线性结构 1.2 非线性顺序结构 二、稀疏数组 2.1 基本介绍 2.1.1 应用场景 2.1.2 实现思路 2.2 代码实现 2.2.1 原始数组 2.2.2 原始数组转化为稀疏数组 2.2.3 稀疏数组转化为原始数组 三、队列的应用场景和介绍 3.1 数组模拟队列 3.1.1数组模拟队列的…
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Find My资讯|Seinxon推出支持苹果 Find My 防丢卡

Find My资讯|Seinxon推出支持苹果 Find My 防丢卡

在美国&#xff0c;平均每个人每年丢失 3,000 件物品。而在 2021 年&#xff0c;Pixie 数据显示&#xff0c;丢失产品的更换成本超过 25 亿美元。每周超过两次&#xff0c;将近 1/4 的美国人丢失房门钥匙、钱包、宠物、电话、眼镜、耳机、遥控器、手提箱或孩子最喜欢的物品。 …
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GIT系列（七）切换ssh连接，上传不再输入账号、密码

GIT系列（七）切换ssh连接，上传不再输入账号、密码

文章目录前言操作流程前言 使用HTTP连接方式时&#xff0c;上传代码总是需要登录&#xff0c;键盘都打坏了&#xff0c;切换SSH可以无需密码&#xff0c;直接上传。 操作流程 step 1 确保在git服务器已经部署本机公钥。 没有配置SSH的&#xff0c;戳这里 GIT系列&#xff08;…
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k8s教程（18）-pod之DaemonSet（每个node上只调度一个pod）

k8s教程（18）-pod之DaemonSet（每个node上只调度一个pod）

文章目录01 引言02 DaemonSet2.1 应用场景2.2 举例2.3 注意事项03 文末01 引言 声明&#xff1a;本文为《Kubernetes权威指南&#xff1a;从Docker到Kubernetes实践全接触&#xff08;第5版&#xff09;》的读书笔记 DaemonSet是 Kubernetes1.2 版本新增的一种资源对象&#xf…
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事件轮询机制 Event Loop、浏览器更新渲染时机、setTimeout VS setInterval

事件轮询机制 Event Loop、浏览器更新渲染时机、setTimeout VS setInterval

目录 1. 事件轮询机制&#xff08;Event Loop&#xff09;是什么 1.1 宏任务、微任务 1.2 Event Loop 循环过程 1.3 经典题目分析 1.3.1 第一轮事件循环 1.3.2 第二、三次事件循环 1.3.3 参考文章 2. async、await 在事件轮询中的执行时机 3. 浏览器更新渲染时机、Vue…
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线上使用雪花算法生成id重复问题

线上使用雪花算法生成id重复问题

项目中使用的是hutool工具类库提供的雪花算法生成id方式&#xff0c;版本使用的是5.3.1 <dependency><groupId>cn.hutool</groupId><artifactId>hutool-all</artifactId><version>5.3.1</version></dependency>雪花算法生成id…
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