赤霉素3β-羟化酶的下调增强了大豆的光合作用并提高了种子产量

文章信息

题目：Downregulation of a gibberellin 3β-hydroxylase enhances photosynthesis and increases seed yield in soybean

刊名：New Phytologist

作者：Fang Huang,Zhixi Tian,Deyue Yu et al.

单位：Nanjing Agricultural University

日期：09 April 2022‍

摘要

种子产量主要取决于种子数量和种子重量，是大豆育种的主要目标。识别产量相关性状的基因具有重要意义。

通过联合连锁图谱和100粒重的全基因组关联研究，我们克隆了GmGA3ox1，这是一种编码赤霉素3β-羟化酶的基因，它是赤霉素合成途径中的关键酶。

基因组测序鉴定出一种有益的GmGA3ox1单倍型，有助于提高种子重量，大豆转化子进一步证实了这一点。CRISPR/Cas9产生的gmga3ox1突变体显示出较低的种子重量，但通过增加种子数量提高了种子产量。gmga3ox1突变体减少赤霉素生物合成，同时增强光合作用。GmGA3ox1的敲除导致许多光合作用相关基因的上调，特别是编码核酮-1,5-二磷酸羧化酶加氧酶（Rubisco）活性的GmRCA家族。基本亮氨酸拉链转录因子GmbZIP97和GmbZIP159，在gmga3ox1突变体中均上调，并由赤霉素合成抑制剂尤尼康唑诱导，可与GmRCAβ的启动子结合并激活其表达。对2700多份大豆材料的基因组序列分析表明，GmGA3ox1正逐渐用于现代育种。

我们的结果阐明了GmGA3ox1在大豆产量中的重要作用。这些发现揭示了大豆和其他作物未来高产育种的重要线索。

技术路线

The soybean (Glycine max (L.) Merr.) materials were used for trait collection

Population phenotyping analysis

Linkage mapping

GWAS

RNA extraction and quantitative real-time PCR (qRT-PCR)

b-Glucuronidase (GUS) staining

Vector construction for Arabidopsis transformation

Overexpression and knockout of GmGA3ox1 in soybean

Transcriptome profiling

Scanning electron microscopy

Net photosynthesis rate, Rubisco activity and sugar contentdetermination

Yeast one-hybrid (Y1H) assays

Luciferase (LUC) transient expression assays

Phylogenetic analysis\Haplotype analysis of GmGA3ox1

主要结果

3.1 联合连锁分析和GWAS鉴定与大豆种子重量相关的qSW7-1

我们从184个RIL（来源于KF No.1和NN 1138-2之间的杂交）的二分群体中收集了三种环境中的100粒种子重量数据。100粒种子的重量在不同环境中表现出很大的差异，NN 1138-22的100粒重量高于KF No.2（表S2）。RIL的频率分布呈正态分布（图S1a），表明种子重量是一个复杂的数量性状，由多个基因控制。

通过连锁图谱鉴定了分布在第7、14、17和19号染色体上的共7个显著QTL（图1a）。其中，只有位于7号染色体上的QTL（命名为qSW7-1）在两种环境中被共同检测（图1a）。其他研究也报道了该基因座。然后，在六个环境中收集了含有211份大豆材料的自然群体的100粒种子重量数据。与RIL相似，自然种群的频率分布也呈正态分布（图S1b；表S3）。GWAS鉴定出49个显著的SNP，分布在第1、2、4、5、6、7、8、9、10、11、16、17、18和20号染色体上（图1b–g；表S4）。在这些SNP中，在所有六种环境中都检测到了7号染色体上最显著的SNP AX-94034903（P=5.29 9 10–7）。

Fig. 1

SNP AX-94034903位于qSW7-1内（图2a）。在多个环境中的两个种群中检测到的重叠区域表明，该基因座对种子重量的控制做出了强大而重要的贡献。

Fig. 2a

3.2 编码GA3b羟化酶的GmGA3ox1是候选基因

通过连锁图谱确定的QTL qSW7-1的置信区间和通过GWAS分析确定的显著SNP AX-94034903显示了7号染色体上123.2kb的重叠区域（图2a）。在该重叠区域中发现了17个基因模型，其中11个基因根据KF No.1和NN 1138-2的全基因组测序显示了亲本系之间的核苷酸序列差异（图2a；表S5）。然后我们测定了这11个基因的转录水平。Glyma07g033800，其序列仅在GmGA3ox1的启动子区域中在两个亲本之间变化（NN 1138-2和KF No.1分别在启动子中插入了7对和20对连续的TA碱基；图2a），在NN 1138-22中的表达比在KF No.1中高出近25倍（图2b）。这表明启动子区13对连续TA的缺失导致Glyma07g033800的高表达。这增加了NN 1138-2中的100粒种子重量。其他10个基因的转录物丰度在亲本系之间没有显著变化（图S2a）。

系统发育分析表明Glyma07g033800是拟南芥AtGA3ox1的直系同源基因（图S2b），它编码一种催化生物活性的GA生物合成的GA3b羟化酶，而其他10个基因未注释为与植物产量相关（表S5）。Glyma07g033800基因被命名为GmGA3ox1，用于进一步研究。

我们检查了GmGA3ox1在不同大豆组织中的表达模式，发现该基因主要在叶和茎中表达（图S3a）。这一发现与通过GUS染色在这两种组织中检测到的GmGA3ox1的强启动子活性一致（图S3b–f）。为了初步检查GmGA3ox1的功能，我们在拟南芥atga3ox1突变体中异位表达GmGA3 ox1，该突变体表现出半干旱表型，种子重量和莲座大小降低（图2c，d）。表型分析表明，GmGA3ox1的过表达显著增加了atga3ox1突变体的莲座大小、1000粒重和种子产量（图2c–g）。总之，GmGA3ox1可能是种子重量的候选基因。

Fig. 2

3.3 GmGA3ox1的自然变异与种子重量相关

为了探索大豆中GmGA3ox1的遗传变异，对373份主要来自中国不同地理区域的材料进行了全基因组测序：该小组包括121种野生大豆植物（G.soja）、197个地方品种和55个品种（图S4a）。在自然条件下对373份材料的田间评估显示，栽培大豆植株的100粒重显著高于野生大豆植株，品种的物候期最大（图S4b）。根据这些重测序数据，在GmGA3ox1的4.2kb基因组区域中发现了19个多态性位点，该区域从启动子延伸到30-UTR。

基于这些结果，定义了30个GmGA3ox1单倍型，并在系统发育上分为两个主要类群，命名为H-I和H-II（图3a，S4c）。含H-I的材料的100粒重显著高于含H-II的材料（图3b），而在H-I和H-II之间没有观察到种子产量的显著差异（图S5a）。这些结果表明，GmGA3ox1的H-I可能是提高大豆种子重量的有益单倍型。

基于GmGA3ox1的关联分析表明，10个多态位点与100粒重显著相关。其中，三个多态性位点位于启动子区，五个多态性位置位于外显子区，导致非同义突变（图S5b，d）。我们检测了69份大豆材料叶片中GmGA3ox1的转录丰度（表S6）。GmGA3ox1表达与100粒种子重量呈正相关（r=0.52，P<0.0001），但与种子产量无关（r=0.21，P=0.1）（图3c，S5c）。图3c中偏离趋势线的几个点可能是由GmGA3ox1中的五个非同义突变引起的（图S5b，d）。此外，H-Ipro单倍型中GmGA3ox1的表达水平显著高于H-IIpro单倍型（图S5e）。总之，这些结果表明，GmGA3ox1表达的差异可能是大豆种子重量表型变异的原因。

Fig. 3

3.4 GmGA3ox1有益单倍型的应用增加大豆种子重量

将大豆地方品种Jurongbianqingdou 的GmGA3ox1 H-I的4.2kb基因组序列导入具有H-II背景的品种W82；转基因由其自身的启动子驱动（图3d）。与W82相比，转基因系表现出GmGA3ox1的高表达，并在自然条件下表现出更高的种子重量表型（图3e，g，h）。

种子大小的进一步比较表明，转基因系的种子长度长于W82，而种子宽度或厚度没有显著差异（图S6f–i）。H-Ipro:H-I系显著增加了植株高度，但不影响主茎的节数（图S6a，b）。此外，H-Ipro:H-I系略微减少了豆荚和种子数量，因此，尽管100粒种子重量增加，但种子产量略有提高，但没有显著提高（图3f，I，S6c–e）。这些结果表明，GmGA3ox1是调节种子重量的关键基因，可能在控制大豆种子产量方面发挥潜在作用。

Fig. 3e-h

3.5 GmGA3ox1的敲除降低了种子重量，但提高了种子产量

为了进一步验证GmGA3ox1在产量相关性状中的调节作用，我们应用短回文重复序列（CRISPR/Cas9）突变来敲除大豆品种Jack（其单倍型属于H-I组）中的GmGA3 ox1。获得了两个含有四种类型纯合突变的转基因系（命名为KO-1a#、KO-1b#、KO-2a#、KO-2b#）；这些突变涉及源自GmGA3ox1第一外显子中大InDel片段的移码（图S7）。

我们在自然条件下测量了gmga3ox1突变体和Jack植物的农艺性状。与Jack相比，GmGA3ox1敲除的大豆植株表现出显著更低的种子重量和长度，但种子厚度和宽度没有（图4a–c，S8c–e），表明GmGA3 ox1正调节大豆种子重量和种子长度。此外，gmga3ox1突变体的分枝、荚和种子数量显著高于Jack，这些增加导致种子产量显著增加（图4a，d–g）。gmga3ox1突变体的株高明显更短，尽管主茎的节数保持不变（图4a、S8a、b）。比较了gmga3ox1突变体和Jack之间节间V的纵向截面；数据显示，gmga3ox1突变体中节间的细胞宽度（而不是细胞长度）明显被压缩（图4h–k）。这些结果表明，GmGA3ox1突变在提高大豆产量方面发挥了重要作用。

Fig. 4

3.6 GmGA3ox1的敲除降低GA1和GA4含量

为了阐明GmGA3ox1在GA生物合成中的作用，在GmGA3ox1突变体和Jack中测量了8种GA（由GA3ox和前体GA9、GA19、GA20和GA24催化的生物活性GA1、GA3、GA4和GA7）的含量。gmga3ox1突变体中GA1和GA4的含量显著低于Jack，而GA3、GA19、GA20或GA24的含量没有发现差异（图5a、b、S9）。由于大豆中GA7含量低，GA7无法检测，GA9也无法定量。

此外，我们研究了GA应用对gmga3ox1突变体高度的影响。重复施用1mg l -1 GA3引发了gmga3ox1突变体的茎伸长，并使植株高度恢复到对照的高度（图5c，d）。总之，这些结果表明GmGA3ox1的突变抑制了大豆中GA的生物合成。

Fig. 5

3.7 GmGA3ox1突变极大地上调了与光合作用相关的基因，从而提高了光合作用

我们使用RNA测序（RNA-seq）来探索gmga3ox1突变体和Jack之间差异表达的基因。与Jack相比，在gmga3ox1突变体中共鉴定出1033个上调的DEG和1445个下调的DEG（表S7）。GO富集分析表明，显著富集的GO大类通常与光合作用有关——光系统、光系统I、光系统II和光系统II氧释放复合体（图5e）。参与光合作用相关途径的所有DEG都上调，包括乙酰辅酶a羧化酶羧基转移酶、光收获复合物I叶绿素a/b结合蛋白、光系统I蛋白、光系II蛋白等（图5f）。特别是，两个Rubisco活化酶基因GmRCAb和GmRCA11在gmga3ox1突变体中上调（图5f；表S7）。此外，共鉴定了189个转录因子，包括21个WRKY、13个bHLH、13个NAC和6个bZIP（表S7）。

鉴于光合作用是决定植物种子产量的重要因素之一，我们测量了gmga3ox1突变体和Jack的净光合作用速率。与Jack相比，GmGA3ox1的敲除显著提高了净光合速率（图5g）。KO-1b#叶片中的蔗糖、果糖和葡萄糖含量高于Jack（图5h）。此外，参与光合作用的关键酶Rubisco的活性在gmga3ox1突变体中显著高于Jack（图5i）。这些结果表明，敲除GmGA3ox1可提高大豆的光合作用。

Fig. 5

3.8 GmbZIPs反式激活Rubisco活化酶基因GmRCAb的表达，该模块由低GA含量高度诱导

鉴于gmga3ox1突变体中光合作用相关途径的DEG都被上调，光合作用速率、Rubisco活性和糖含量也增加，我们接下来研究了潜在的分子机制。RCA编码Rubisco活化酶，在光合作用中催化Rubicso的活化中起着至关重要的作用。我们之前的研究表明，GmRCAb的表达水平与光合作用速率和种子产量呈正相关。GmRCAb和GmRCA11在gmga3ox1突变体中上调（图5f；表S7）。大豆有五个GmRCA基因（GmRCAa、GmRCAb、GmPRCA03、GmRC-A11和GmRCA14），它们彼此具有高度的序列相似性。

我们的研究报告，GmbZIPs可以与GmRCAs的启动子结合。因此，我们随后确定了六种差异表达的GmbZIPs和五种GmRCA之间的调节关系。GmbZIP71和GmbZIP130由于其用于PCR扩增的低表达而被排除。通过Y1H测定，GmRCA11被排除，因为1000 ng/ml 1 AbA不能抑制GmRCA12启动子的基础表达。含有GmbZIP97和GmbZIP159的克隆与GmRCA14pro或GmRCAbpro报告菌株一起在SD/-Leu/AbA250培养基上生长良好，而其他组合，包括涉及pGADT7（AD）空载体的组合，没有生长（图6a），表明GmbZIP77和GmZIP159与GmRC-A14和GmRCAb的启动子相互作用。

此外，烟草中的双荧光素酶报告子测定显示，GmbZIP97和GmbZIP159都增加了GmRCAb的启动子活性，但不影响GmRCA14的启动子（图6b–d）。通过qRT-PCR进一步分析GmbZIP97、GmbZIP159和GmRCAb的表达；结果表明，它们在gmga3ox1突变体中的表达高于Jack（图6e，f）。鉴于GmGA3ox1的敲除抑制了GA生物合成，我们随后检查了GmbZIP97、GmbZIP159和GmRCAb转录物对低GA含量的反应。在用GA合成抑制剂Uni（Jack/Uni）处理的Jack植物中，GmbZIP97、GmbZIP159和GmRCAb的表达水平显著高于用H2O（Jack/H2O）处理的那些植物（图6g–i），表明GmbZIPs–GmRCAb模块在低GA含量的反应中被强烈诱导。gmga3ox1突变体光合作用的增加趋势可能部分归因于GmbZIPs–GmRCAb的高表达。

此外，空间表达谱显示，与其他组织相比，GmRCAb在大豆叶片中高度表达（图S10），这与GmGA3ox1的表达模式一致。我们一起指出了一个假设模型，通过该模型，GmGA3ox1突变体的种子产量增加。在叶片中，GmGA3ox1的敲除降低了生物活性GAs的含量，并增加了GmbZIP97和GmbZIP159的表达。反过来，GmbZIP67和GmZIP159与GmRCAb的启动子结合，并强烈诱导其表达。GmRCAb激活更多Rubisco以增加光合作用。光合作用的增加确保了从叶子到种子的充足能量传输。GmGA3ox1的敲除降低了种子重量/大小，但增加了分枝和荚数，并缩短了植株高度，最终提高了种子产量（图6j）。

Fig. 6

3.9 在大豆驯化过程中，GmGA3ox1正逐渐用于现代育种

然后，我们使用来自2714份材料的大豆泛基因组组的全基因组测序数据，研究大豆驯化过程中GmGA3ox1的进化史。重新测序数据中GmGA3ox1内一个位点检测到不同碱基的杂合大豆被排除在进一步分析之外。在去除MAF＜0.03的多态性后，共鉴定了23个SNP和7个INDEL（插入和缺失）（图S11）。通过分析GmGA3ox1启动子和基因组区域中的核苷酸变体定义了40个单倍型，然后根据系统发育分析将其细分为两组（H-I和H-II）（图7a，S11）。与373份材料的单倍型分析一致，与栽培大豆植株的H-II相比，H-I也显示出显著更大的100粒重（图3b、7b）。从野生大豆植物到栽培大豆植物，尤其是品种，有益H-I的频率大大增加（图7c），这表明GmGA3ox1正逐渐用于现代育种。地理分布分析表明，有益的H-I在南部地区强烈富集，而H-II主要分布在北部地区（图7d）。这些结果表明，北方地区的大多数大豆品种仍然不含H-I，这些品种可以通过引入这种精英单倍型来改良。

Fig. 7

结论

在这里，我们结合连锁分析和全基因组关联研究（GWAS）来鉴定一个粒重的主要QTL（qSW7-1），该QTL位于先前报道的大豆7号染色体区域附近。对转化子的表型分析表明，GmGA3 ox1正调节大豆种子重量。GmGA3ox1的敲除通过促进分枝、荚和种子数量以及光合作用，导致种子产量显著增加。进一步分析表明，GmbZIP97和GmbZIP159在gmga3ox1突变体中被诱导，并反式激活Rubisco活化酶（RCA）基因的表达。此外，我们还发现，在大豆驯化过程中，GmGA3ox1正逐渐用于现代育种。GmGA3ox1可作为大豆育种计划的目标。

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原文链接：

https://nph.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/nph.18153

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https://www.scientsgene.com/h-nd-132.html#_np=107_423

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