期刊：Science of the Total Environment       

影响因子：10.753       

发表时间：2022

样本类型：Bosea sp. Ads-6菌株

客户单位：中国科学院微生物研究所

一、研究背景

环境中抗生素残留和耐药性的增加引发了许多亟待解决的问题。这些污染物在废水或其他环境中日益积累，不能被人和动物体有效吸收或降解，导致了由残留抗生素、抗生素耐药微生物和ARGs组成的新污染系统的出现，给生态环境的平衡和我们的健康带来了巨大的风险。阿莫西林 (AMX) 是一种常见的微量有害污染物，对环境和人类健康构成极大风险。微生物降解是一种很有前途的去除污染物的方法，但是目前没有找到能够在 AMX 上生长和降解的菌株，并且关于 AMX 降解途径、机制和遗传决定因素的知识是不全面的。本研究分离并表征了一种有效的 AMX 降解菌株——Bosea sp. Ads-6。

二、实验设计

1、研究对象

废水处理厂活性污泥中分析的菌株Bosea sp. Ads-6。

2、实验处理

在葡萄糖和(NH4)2SO4作为碳源和氮源上生长的Bosea sp. Ads-6 细胞样品命名为A0 。在 AMX 上生长的 Ads-6 细胞样品并在 AMX 消耗一半时命名为 A1 。添加 AMX 被完全消耗的Ads-6 细胞样品后命名为A2。

3、研究方法

Bosea sp. Ads-6菌株基因组完成图测序，比较转录组和蛋白质组测序。

图 实验设计

三、实验结果

1、AXM降解菌株的分离和鉴定

研究分离了总共 12 个纯菌株，但降解实验表明，只有 Ads-6 菌株可以在 AMX 作为唯一碳源和氮源的情况下降解和生长。Ads-6菌株是革兰氏阴性菌，杆状和具有极性鞭毛的运动（图1b）。这些形态特征与Bosea属成员的描述一致，基于16S rRNA 基因序列的系统发育树（图 1c）表明Ads-6 在 Bosea 属内形成了明显的聚类。

图1  Ads-6的形态和系统发育位置

2、Ads-6 的 AMX 降解特性和 TOC 的去除

 Ads-6 在 AMX 浓度为 0.25 至 2 mM 时表现出优异的 AMX 降解能力（图 2）。高达 1 mM 的 AMX 可在 24 小时内完全降解（图 2b-d）。随着AMX含量的降低，随后形成并积累了两种降解产物（DP1和DP2），然后在所有实验组中进一步降解（图2b-e）。Ads-6 对 AMX 表现出有效的分解代谢能力，6 天内去除了接近 58% 的 TOC（图 2f）。 

图2  初始AMX浓度对其降解和Ads-6去除TOC的影响

同时发现Ads-6 在 pH 6.0-8.0 的碱性条件下表现出更高的降解能力，确定了30℃是Ads-6降解AMX的最佳降解温度。

验证了其他C\N源对 Ads-6 降解 AMX 的影响，发现添加葡萄糖不会影响 Ads-6 的降解能力。但酵母提取物和 AXM同时存在的情况下，Ads-6 的生长比仅存在酵母提取物的情况要好得多。

3、降解产物的鉴定和降解途径的预测

通过HPLC-MS 鉴定了 8 个降解产物（DP），其中DP5、DP8 和 DP9 是新发现的。发现了两个具有不同光谱峰的 DP（DP1 和 DP2），将其鉴定为 AMX青霉酸的互变异构体。基于这一结果，提出了一种在 Ads-6 中新的 AMX 生物降解途径（图 3）。

图3  Ads-6对AMX的降解途径

4、Ads-6中AMX的降解机制

对Ads-6的全基因组进行了测序和注释，确定Ads-6 的基因组大小为 5.19M，包含一条染色体和两个环状质粒。发现了 10 个 β-内酰胺酶结构和青霉素结合蛋白基因，找到了参与 4-羟基苯甲酸羟基化和β-酮己二酸途径的原儿茶酸分支的基因（图 4b），以及使 Ads-6 能够以 AMX 作为唯一氮源的氨同化相关基因。还发现了Ads-6在复杂的重金属污染环境中也具有环境生物修复的潜力。

图4  通过比较转录组和蛋白质组分析揭示的参与AMX降解的基因

比较转录组结果表明，与 A0 相比，A1 中的 47 个基因和 A2 中的 433 个基因显著上调。其中，一个含有 bla 基因的基因簇（图 4a）在添加 AMX 后明显上调（图 4a）。在比较蛋白质组分析中也发现了类似的结果。转录组分析还显示，与 A0 相比， A2 中与 β-酮己二酸途径的原儿茶酸分支相关的所有基因在转录水平上均显著上调，除了编码 3-羧基-顺式、顺式-粘康酸环异构酶（图 4c）。Ads-6 中完整的 4-羟基苯甲酸酯降解途径的存在意味着其在降解其他芳香族污染物方面的巨大潜力。

四、研究结论

高效的 AMX 降解菌株 Bosea sp Ads-6 可以在 AMX 作为唯一的碳源和氮源上生长。Ads-6 在初始 AMX 浓度 2.0 mM、pH 6.0–8.0、温度约 30 °C 以及存在其他碳或氮源的情况下具有高效 AMX 降解能力。通过转录组和蛋白质组的比较研究，证明β-内酰胺酶和L，D-转肽酶或其同源酶是AMX初始降解的功能酶。β-酮己二酸酯途径的4-羟基苯甲酸酯羟基化和原儿茶酸酯分支被确认为下游降解途径。本研究将为未来AMX微生物降解的研究提供坚实的基础。

参考文献

Degradation of amoxicillin by newly isolated Bosea sp. Ads-6. Science of the Total Environment ,2022.