近期，Cell 刊登了清华大学施一公课题组大作：Structural basis of γ-secretase inhibition and modulation by small molecule drugs，该文阐述了 γ-分泌酶结合三种小分子抑制剂 (GSI) 和一种调节剂 (GSM) 的冷冻电镜结构，并首次展现了 γ-分泌酶结合底物与药物的过程。

提到大名鼎鼎的 γ-分泌酶，肯定有小伙伴抢答“它是淀粉样蛋白前体蛋白 (APP) 的切割酶，与阿尔茨海默症有关”，但是今天，我们要说的是 γ-分泌酶的另一重身份——Notch 通路激活的重要切割酶。
Notch 信号通路是一条在进化中高度保守的，决定细胞命运的重要信号通路之一。
 

大多经典的信号通路 (如 RTK 信号通路) 遵循“信号-受体-信号转导 (产生二次信使)-细胞核-转录”的信号级联放大模式，而 Notch 通路则不按照这个套路出牌：Notch 受体与邻近细胞的配体相互作用介导短时通讯，从细胞表面到细胞核基因组的信号是直接的，线性的，没有信号级联放大的过程。
 

经典信号通路中，细胞膜上的受体就像信号接收器，接受外源信号，继而发生下游级联放大反应，其配体可源于细胞外基质。而 Notch 信号通路的激活至少需要两个细胞，发生细胞之间的直接“对接”，细胞 A 提供配体，细胞 B 提供受体，是一种独特的依赖蛋白酶切的信号传导模式。
 

Notch 通路由四部分组成：Notch 受体 (Notch1/2/3/4)，Notch 配体 (Delta-like ligands, DLL1/3/4；Jagged ligands, JAG1/2)，CSL-DNA 结合蛋白，下游靶基因 (Hes 家族，MYC 等)。以上 4 个因素，任何一个因素改变都会对 Notch 信号传递产生影响。

Notch 的受体和配体都是膜蛋白，Notch 受体与配体结合后，经过酶切，把有转录调节活性的 Notch 蛋白片段 (NICD 或 ICN) 释放出来，再与转录因子 CSL 结合，调节下游基因表达。
 

行走江湖，Notch 有著名“三剪”。

一剪 Notch 现形：Notch 以无活性的单肽前体形式在内质网中合成，此时的未成熟蛋白包括 Notch 膜外受体部分，跨膜区域以及胞内结构域 NICD 三个部分。Notch 初始蛋白被合成之后，转运至细胞高尔基体内，被高尔基体网络中的 Furin 转化酶蛋白水解切割，经过第一次酶切 (S1 cleavage) 后形成异二聚体形式的成熟 Notch 受体并转运至细胞表面。

二剪内外殊途：细胞膜上成熟 Notch 异二聚体的胞外结构域与其他细胞的配体结合，受体配体结合后发生构象变化，在 ADAM 金属蛋白酶 (ADAM10 或 ADAM17/TACE) 切割的作用下发生第二次酶切 (S2 cleavage)，此刻受体膜外部分完全被切掉。

三剪“成就” Notch：第二次酶切后剩余的其他部分，被 γ-分泌酶进行关键性的最后一切 (S3 cleavage)，形成可溶性 NICD 入核。

NICD 进入细胞核后，与 CSL 等转录蛋白结合，将原本“协同抑制复合物”转换为“协同活化复合物”，进而与 DNA 形成多蛋白-DNA 复合体，激活下游相关基因的表达。

Notch 信号通路机制就是这么简单，那么在实验中是怎样研究 Notch 通路的呢？
 

不像其他通路 (如 RTK、MAPK 等)，Notch 通路没有磷酸化之类的指标可以检测。在文献里面最直观的实验手段就是使用 siRNA、shRNA 特异性沉默 Notch 蛋白，或者使用小分子抑制剂，如 γ-分泌酶抑制剂 (GSI)。

以 Li Yi 等人的 Notch 相关研究文献 (PMID: 31382985) 为例，作者团队通过不同实验方法验证了神经胶质瘤起始细胞 (GICs) 中完整的 Notch1-CXCR4-PI3K 信号通路，证明了 Notch1 通过调节趋化因子系统 CXCL12/CXCR4，促进胶质瘤起始细胞的侵袭、自我更新和生长。
 

■ RNA 沉默 (siRNA 与 shRNA)

该团队首先通过磁珠分选 (MACS) 的方法，富集 U87 和 U251 胶质瘤细胞的 CD133+ (肿瘤起始细胞标记物) 细胞。CD133+ 胶质瘤细胞球中表现出高的 Notch1 活性 (图 4a，橘红色荧光)。同时，免疫荧光结果显示，与 CD133+ 胶质瘤细胞球中，Notch1 阳性胶质瘤细胞占很大比例，CXCR4 阳性胶质瘤细胞仅占 CD133+ 胶质瘤细胞球团的一小部分。但是，这些 CXCR4 与 Notch1 荧光染色共定位于球体的周围 (图 4b 黄色荧光共定位)。
 

为进一步研究 Notch1 在 GICs 中发挥的作用，作者团队建立了稳定的 Notch1 敲降神经胶质瘤起始细胞系 (U87-GIC/U251-GIC shNotch1)。如图 5a 所示，shNotch1 细胞系中 Notch1 信号通路蛋白 (Notch1, Hes1) 低表达，CXCR4 表达显著下调。并且shNotch1 组中 Notch1 的下调可以显着抑制 GICs 的自我更新、侵袭和迁移，如图 5b-d。  
 

■ 使用小分子抑制剂

γ-分泌酶抑制剂是最早发现和最大的一类 Notch 通路靶向药物，能阻止 Notch 受体的第 3 次酶切，从而阻止 NICD 的释放。

前面提到，Notch1 影响 GICs 的自我更新和生长，为进一步证明这一机制，作者团队使用了 γ-分泌酶抑制剂 MK0752 来抑制 Notch1 途径。MK0752 剂量依赖性降低了活化的 Notch1 (NICD) 的蛋白表达。同时在 U87/U251GICs 中，Notch1 通路被 shRNA 或 MK0752 下调，CXCR4 的表达以及 AKT 和 mTOR 的磷酸化水平也被显着抑制。
 

此外，Norihiko Saito 等人证明了 GICs 对 γ-分泌酶抑制剂敏感程度并不相同 (PMID: 24038660)。根据 GICs 对 γ-分泌酶抑制剂给药的反应分为 Responder 和 Non-Responder 组。Responder 组中，Notch1、Notch1 NICD 和 Notch1 下游相关蛋白 (包括 Hes1、Hes3 和 Hes5) 均高表达，在 Non-Responder 组中则不然。γ-分泌酶抑制剂 DAPT 以剂量依赖性方式抑制 NICD、Hes1、Hes3 和 Hes5 的表达，而 Notch1 的表达没有改变。同样都是神经胶质瘤起源细胞，但这两组细胞对 DAPT 的响应并不相同。
 

总结：
1、Notch 信号通路是线性的信号通路。
2、Notch 信号通路激活后的检测，通常是检测通路被激活后的 NICD 或者下游一些靶基因。
3、针对 Notch 信号通路的抑制剂，最主要的一大类是 γ-分泌酶抑制剂，但是并不是所有的细胞系都对抑制剂高度敏感，要结合文献选择抑制剂。
 

Notch 通路的相关抑制剂

γ-分泌酶 (γ-secretase) 抑制剂 (GSI)

DAPT 具有口服活性的 γ-secretase 抑制剂，具有神经保护活性，并可用于自身免疫性和淋巴增生性疾病，退化性疾病和癌症的研究。

YO-01027 二肽类 γ-secretase 抑制剂，裂解 Notch 和 APPL 的 IC50 分别为 2.92 nM 和 2.64 nM。

BMS 299897 有效的 γ-分泌酶抑制剂，抑制 β-淀粉样前体蛋白裂解的选择性比 Notch 裂解更高。

LY-411575 γ-分泌酶抑制剂，能够抑制 Aβ40 蛋白的产生，同时抑制 Notch 分裂。

靶向 Notch 转录复合体的抑制剂

IMR-1 Notch 抑制剂，阻止 Maml1 募集到染色质上的 Notch 三元复合体 (NTC)，抑制 Notch 靶基因转录。

IMR-1A Notch 抑制剂，IMR-1 的酸代谢物，相对于 IMR-1 的效力增加。

CB-103 靶向 NOTCH 转录复合体，具有抗肿瘤活性。

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缩写：
ADAM: Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein
TACE: TNF-converting enzyme
NICD: Notch intracellular domain
CSL: CBF1/Suppressor of hairless/Longevity-assurance gene-1
MAML: Mastermind-like protein 
SKIP: Ski-interacting protein
GICs: Glioma initiating cells

参考文献
1. Domingos Henrique, et al. Mechanisms of Notch signaling: a simple logic deployed in time and space. Development.  2019 Feb 1;146(3):dev172148. 
2. Joseph A Clara, et al. Targeting signalling pathways and the immune microenvironment of cancer stem cells - a clinical update. Nat Rev Clin Oncol. 2020 Apr;17(4):204-232.
3. Jose Manuel Perez Garcia, et al. First-in-human phase 1-2A study of CB-103, an oral Protein-Protein Interaction Inhibitor targeting pan-NOTCH signalling in advanced solid tumors and blood malignancies.Journal of Clinical Oncology 36, no 15_suppl.3. Naoko Takebe, et al. Targeting notch signaling pathway in cancer: clinical development advances and challenges. Pharmacol Ther. 2014 Feb;141(2):140-9.
4. Li Yi, et al. Notch1 signaling pathway promotes invasion, self-renewal and growth of glioma initiating cells via modulating chemokine system CXCL12/CXCR4. J Exp Clin Cancer Res. 2019 Aug 5;38(1):339. 
5. Norihiko Saito, et al. A high Notch pathway activation predicts response to γ secretase inhibitors in proneural subtype of glioma tumor-initiating cells. Stem Cells. 2014 Jan;32(1):301-12