背景介绍

微生物之间的共现(Co-occurrence)可能有以下几种原因，它们可能具有一定的生态关系，或者在生态位上有重叠。

物种的关系可能是此消彼长、或者共增共减。

共现分析是一种网络推断技术，可以用来发现不同目标（例如基因、蛋白质、代谢物、物种等）之间的关系，基于可重复的观测中的丰度或者出现/缺失，尤其是应用在基因组学领域，比如基因调控网络推断。

网络推断技术用于宏基因组学及其存在的问题

目前有两种实现网络的技术：
（1）第一种是基于相似性
不管是基于abundance还是incidence的数据，都可以计算成对物种之间的相似度矩阵，并随机化数据反复计算。考察实际相似度与打乱后相似度的显著性差异。最后保留具有意义的相似度并可视化。

其存在的问题包括：
1.双零问题(double zeros):
微生物数据存在很多的0值。但是我们不知道该物种是低于检测限还是真的不存在。因此当存在很多0，就会得到很高的相似度。如下表所示，增加了0值后相似度显著的升高了。

因此对于双零值，算法中要避免得到很高的相似度。

2. 群落组成的问题：
   由于每个样本测序深度不同，因此即使物种个数相同，所占比例也不同。因此需要标准化，可以用每个样本物种的个数除以总样本物种的个数；或者重抽到相同深度。
   另外pearson和 spearman考虑的是绝对值，因此标准化后会带来很大的偏差。而基于比例或者对数比例(log-ratio)的方法不受数据组成的影响，因为标准化后数据之间的比例不会变。具体如下图所示，标准化后pearson相关性改变了。
   
   （2）第二种实现网络的技术是基于回归
   将物种划分为source和target，使用多元回归计算物种之间的关系。也是要随机化数据重复计算。根据实际回归系数与随机得到的回归系数的关系进行判定。其优点在于可以检测多个物种的关系；并可以预测不对称的关系(如偏利共生)。缺点在于会出现假阳性、过拟合，且难以可视化。
   

实现方法和工具

SparCC

SparCC使用对数比例的方差来计算物种之间的相关性:
$$D(x_i,x_j)=var(log(\frac{x_i}{x_j}))$$

SparCC 对观测到的数据拟合狄利克雷分布，对物种的比例及相关性计算迭代计算多次。最后得到的相关性为分布的中位数。P值采用bootstrap方法计算。

SparCC是基于Python的软件，详见https://bitbucket.org/yonatanf/sparcc/src/default/

MENA

MENA，即分子生态学网络分析流水线（molecular ecological network analysis pipeline）

MENA的核心在于随机矩阵理论(Random matrix theory, RMT)。
- 计算给定阈值的pearson相关矩阵的特征值间距分布；
- 对于整个阈值范围都进行计算；
- 保留分布由高斯分布变为泊松分布的阈值；
- 保留阈值以上的所有相关性。

LSA

LSA，即Local similarity analysis， 计算时间序列之间的相似性。由于考虑了滞后效应，可以得到直接连接和不直接连接的边。这种方法在海洋和湖泊宏基因组中很受欢迎。基本计算原理和基于相似性的网络相同，只是将相似性按照时间进行了分割。

LSA的流程为：

• 时间序列被转换为正态分布;
• 对于每对时间序列，局部相似性得分是使用动态规划的点积计算的（最多允许 3 个间隙）
• 局部相似性得分除以时间序列的长度
• 进行排列(permutation)以评估局部相似性得分的显着性
• 排列(permutation)的p值经过多重检验校正（Bonferroni）
• 网络由具有显着相似性分数的边构成

CoNet

基于组合效应(Ensemble-based)的网络

• 不同相关性计算方法(pearson，spearman,bray-curtis)可表达不同的关系，但是随着阈值的增加彼此的结果会趋同。
• 不同方法也会存在不同的错误，但是对于正确的结果却是一致的。

对于每条边和每种方法，分别计算permutation和bootstrap分布。两者相比较得到最终的P值。

不同相关性计算方法(pearson，spearman,bray-curtis)得出的关系进行合并，以表达最终的关系。

• 合并特定方法得到的p-values
• 合并后的p-value经过多重检验
• 对于小于给定阈值的p-value对应的边进行删除。

处理组合性（compositionality），主要的方法是重新标准化的置换（permutation with renormalization），称为ReBoot。

1. 将所有的类群放在一个组内
2. 对选定的分类单元对进行置换洗牌
3. 按组重新归一化矩阵
4. 计算分类单元对在打乱的、重新归一化的丰度上的随机分数

置换测试：消除相关性，但也消除由于组合性引起的任何偏差
重新标准化的置换：转移null分布

CoNet的特点：

• 可以运行在Cytoscape plugin或者命令行
• 适用于丰度数据，也适用于存在/缺失数据
• 支持QIIME OTU表格式
• 从谱系中分配更高级别的分类单元并计算它们之间的相关性
• supports row groups
• 支持环境元数据
• 集成外部网络推理包，例如 minet（基于互信息的网络推理）和apriori（关联规则挖掘算法）
• 提供各种预处理步骤、过滤选项和缺失值处理
• 设置加载/保存
• 分数分布绘图
• 较好的文档和教程

SPIEC-EASI

SPIEC-EASI（SParse Inverse Covariance Estimation for Ecological Association Inference）利用了这样一个事实，即在某些假设下（考虑所有相关变量并且数据是多元正态分布的），逆协方差矩阵对应于没有间接边的网络。 简而言之，SPIEC-EASI 根据测序数据估计逆协方差矩阵。 使用逆协方差矩阵的网络推理在文献中也称为图高斯模型，逆协方差矩阵也称为精度或偏相关矩阵。

SPIEC-EASI 在R中有其实现，顺便说一下，SPIEC-EASI 包还为 SparCC 提供了替代实现。 有关 SPIEC-EASI 的详细信息，请查看PLoS Computational Biology 11(5) e1004226。

library(devtools)
install_github("zdk123/SpiecEasi")
library(SpiecEasi)

source('http://bioconductor.org/biocLite.R')
biocLite('phyloseq')
library(phyloseq)

install_github("hallucigenia-sparsa/seqtime") 
library(seqtime)

总结

• MENA强项在于阈值的算法，且不需要人为设定阈值。
• SparCC特色在于相关性的计算方法。
• LSA引入了时间序列。
• CoNet将多种相关性综合考量。

另外，网络推断的局限：

• 相似性不等于因果性
• 类群可能具有显着的相似性分数，因为它们对环境变量(生态位共享)的反应相似或因为它们相互作用（直接或间接）或两者兼而有之
• 即使时间序列不相似，类群也可能相互作用（例如确定性混沌）

参考资料

[1] Microbial association network construction tutorial
[2] Inference of microbial association networks from metagenomic data
[3] SPIEC-EASI