GEO生信数据挖掘（四）数据清洗（离群值处理、低表达基因、归一化、log2处理）

检索到目标数据集后，开始数据挖掘，本文以阿尔兹海默症数据集GSE1297为例

离群值处理

删除低表达基因

函数归一化，矫正差异

数据标准化—log2处理

完整代码

上节围绕着探针ID和基因名称做了一些清洗工作，还做了重复值检查，空值删除操作。

#查看重复值
table(duplicated(matrix$Gene.Symbol))

#去掉缺失值
matrix_na = na.omit(matrix)  

#基因名称为空删除
matrix_final = matrix_na[matrix_na$Gene.Symbol != "",]

离群值处理

用于处理异常值，将超出一定范围的值替换为中位数，以减少异常值对后续分析的影响。

#数据离群处理
#处理极端值
#定义向量极端值处理函数
#用于处理异常值，将超出一定范围的值替换为中位数，以减少异常值对后续分析的影响。
dljdz=function(x) {
  DOWNB=quantile(x,0.25)-1.5*(quantile(x,0.75)-quantile(x,0.25))
  UPB=quantile(x,0.75)+1.5*(quantile(x,0.75)-quantile(x,0.25))
  x[which(x<DOWNB)]=quantile(x,0.5)
  x[which(x>UPB)]=quantile(x,0.5)
  return(x)
}

#第一列设置为行名
matrix_leave=matrix_final

boxplot(matrix_leave,outline=FALSE, notch=T, las=2)  ##出箱线图
dim(matrix_leave)

#处理离群值
matrix_leave_res=apply(matrix_leave,2,dljdz)

boxplot(matrix_leave_res,outline=FALSE, notch=T, las=2)  ##出箱线图
dim(matrix_leave_res)

删除低表达基因

方案1 ：仅去除在所有样本里表达量都为零的基因（或者平均值小于1）

方案2：仅保留在一半（50%，75%...自己选择）以上样本里表达的基因

#删除 低表达基因

#仅去除在所有样本里表达量都为零的基因（平均值小于1）

# 计算基因表达矩阵的平均值
gene_avg <- apply(matrix_final, 1, mean)
# 根据阈值筛选低表达基因
filtered_genes_1 <- matrix_final[gene_avg >= 1, ] # 表达量平均值小于1的过滤
dim(filtered_genes_1)


#+================================
#常用过滤标准2(推荐)：
#仅保留在一半以上样本里表达的基因

# 计算基因表达矩阵每个基因的平均值
gene_means <- rowMeans(matrix_final)

# 计算基因平均值的排序百分位数
gene_percentiles <- rank(gene_means) / length(gene_means)

# 获取阈值
threshold <- 0.25  # 删除后25%的阈值
#threshold <- 0.5  # 删除后50%的阈值
# 根据阈值筛选低表达基因
filtered_genes_2 <- matrix_final[gene_percentiles > threshold, ]

# 打印筛选后的基因表达矩阵
dim(filtered_genes_2)

boxplot(filtered_genes_2,outline=FALSE, notch=T, las=2)  ##出箱线图
#dim(filtered_genes)

#+删除 低表达基因   得到filtered_genes_1 删除平均表达小于1的   得到filtered_genes_2 删除后25%的

函数归一化，矫正差异

#1.归一化不是绝对必要的，但是推荐进行归一化。
#有重复的样本中，应该不具备生物学意义的外部因素会影响单个样品的表达，
#例如中第一批制备的样品会总体上表达高于第二批制备的样品，假设所有样品表达值的范围和分布都应当相似，
#需要进行归一化来确保整个实验中每个样本的表达分布都相似。
#2.归一化要在log2标准化之前做

library(limma) 

exprSet=normalizeBetweenArrays(filtered_genes_2)

boxplot(exprSet,outline=FALSE, notch=T, las=2)  ##出箱线图

## 这步把矩阵转换为数据框很重要
class(exprSet)   ##注释：此时数据的格式是矩阵（Matrix）
exprSet <- as.data.frame(exprSet)

数据标准化—log2处理

如果表达量的数值在50以内，通常是经过log2转化后的。如果数字在几百几千，则是未经转化的。

GSE数据集的注释部分会有说明，常见的标准化处理方法有3种：RMA算法、GC-RMA算法、MAS5算法



#标准化 表达矩阵自动log2化
qx <- as.numeric(quantile(exprSet, c(0., 0.25, 0.5, 0.75, 0.99, 1.0), na.rm=T))
LogC <- (qx[5] > 100) ||
  (qx[6]-qx[1] > 50 && qx[2] > 0) ||
  (qx[2] > 0 && qx[2] < 1 && qx[4] > 1 && qx[4] < 2)


## 开始判断
if (LogC) { 
  exprSet [which(exprSet  <= 0)] <- NaN
  ## 取log2
  exprSet_clean <- log2(exprSet)
  print("log2 transform finished")
}else{
  print("log2 transform not needed")
}

筛选后的基因表达矩阵的箱线图

经过数据清洗后的箱线图

完整代码


# 安装并加载GEOquery包
library(GEOquery)

# 指定GEO数据集的ID
gse_id <- "GSE1297"

# 使用getGEO函数获取数据集的基础信息
gse_info <- getGEO(gse_id, destdir = ".", AnnotGPL = F ,getGPL = F) # Failed to download ./GPL96.soft.gz!

# 提取基因表达矩阵
expression_data <- exprs(gse_info[[1]])

# 提取注释信息
#annotation <- featureData(gse_info[[1]])


#查看平台文件列名
colnames(annotation)

#打印项目文件列表
dir() 

# 读取芯片平台文件txt
platform_file <- read.delim("GPL96-57554.txt", header = TRUE, sep = "\t", comment.char = "#")

#查看平台文件列名
colnames(platform_file)

# 假设芯片平台文件中有两列，一列是探针ID，一列是基因名
#probe_names <- platform_file$ID
#gene_symbols <- platform_file$Gene.Symbol
platform_file_set=platform_file[,c(1,11)]


#一个探针对应多个基因名，保留第一个基因名
ids = platform_file_set
library(tidyverse)
test_function <- apply(ids,
                       1,
                       function(x){
                         paste(x[1],
                               str_split(x[2],'///',simplify=T),
                               sep = "...")
                       })
x = tibble(unlist(test_function))

colnames(x) <- "ttt" 
ids <- separate(x,ttt,c("ID","Gene.Symbol"),sep = "\\...")
dim(ids)

#将Matrix格式表达矩阵转换为data.frame格式
exprSet <- data.frame(expression_data)
dim(exprSet)

#给表达矩阵新增加一列ID
exprSet$ID <- rownames(exprSet) # 得到表达矩阵，行名为ID，需要转换，新增一列
dim(exprSet)
#矩阵表达文件和平台文件有相同列‘ID’，使用merge函数合并
express <- merge(x = exprSet, y = ids, by.x = "ID")

#删除探针ID列
express$ID =NULL


dim(express) 

matrix = express
dim(matrix)
#查看多少个基因重复了
table(duplicated(matrix$Gene.Symbol))


#把重复的Symbol取平均值
matrix <- aggregate(.~Gene.Symbol, matrix, mean)  ##把重复的Symbol取平均值
row.names(matrix) <- matrix$Gene.Symbol  #把行名命名为SYMBOL

dim(matrix)

matrix_na = na.omit(matrix)   #去掉缺失值
dim(matrix_na)

matrix_final = matrix_na[matrix_na$Gene.Symbol != "",]
dim(matrix_final)

matrix_final <- subset(matrix_final, select = -1)  #删除Symbol列（一般是第一列）
dim(matrix_final)
#+  经过注释、探针名基因名处理、删除基因名为空值、删除缺失值 得到最终 matrix_final
#+==================================================================================
#+========================================================================================




#+==================================================================================
#+========================================================================================
#+增加#(2)离群值处理

#数据离群处理
#处理极端值
#定义向量极端值处理函数
#用于处理异常值，将超出一定范围的值替换为中位数，以减少异常值对后续分析的影响。
dljdz=function(x) {
  DOWNB=quantile(x,0.25)-1.5*(quantile(x,0.75)-quantile(x,0.25))
  UPB=quantile(x,0.75)+1.5*(quantile(x,0.75)-quantile(x,0.25))
  x[which(x<DOWNB)]=quantile(x,0.5)
  x[which(x>UPB)]=quantile(x,0.5)
  return(x)
}

#第一列设置为行名
matrix_leave=matrix_final

boxplot(matrix_leave,outline=FALSE, notch=T, las=2)  ##出箱线图
dim(matrix_leave)

#处理离群值
matrix_leave_res=apply(matrix_leave,2,dljdz)

boxplot(matrix_leave_res,outline=FALSE, notch=T, las=2)  ##出箱线图
dim(matrix_leave_res)

#+增加#(2)离群值处理
#+==================================================================================
#+========================================================================================





#+==================================================================================
#+========================================================================================
#删除 低表达基因

#仅去除在所有样本里表达量都为零的基因（平均值小于1）

# 计算基因表达矩阵的平均值
gene_avg <- apply(matrix_final, 1, mean)
# 根据阈值筛选低表达基因
filtered_genes_1 <- matrix_final[gene_avg >= 1, ] # 表达量平均值小于1的过滤
dim(filtered_genes_1)


#+================================
#常用过滤标准2(推荐)：
#仅保留在一半以上样本里表达的基因

# 计算基因表达矩阵每个基因的平均值
gene_means <- rowMeans(matrix_final)

# 计算基因平均值的排序百分位数
gene_percentiles <- rank(gene_means) / length(gene_means)

# 获取阈值
threshold <- 0.25  # 删除后25%的阈值
#threshold <- 0.5  # 删除后50%的阈值
# 根据阈值筛选低表达基因
filtered_genes_2 <- matrix_final[gene_percentiles > threshold, ]

# 打印筛选后的基因表达矩阵
dim(filtered_genes_2)

boxplot(filtered_genes_2,outline=FALSE, notch=T, las=2)  ##出箱线图
#dim(filtered_genes)

#+删除 低表达基因   得到filtered_genes_1 删除平均表达小于1的   得到filtered_genes_2 删除后25%的
#+==================================================================================
#+========================================================================================





#+==================================================================================
#+========================================================================================
### limma的函数归一化，矫正差异  ，表达矩阵自动log2化

#1.归一化不是绝对必要的，但是推荐进行归一化。
#有重复的样本中，应该不具备生物学意义的外部因素会影响单个样品的表达，
#例如中第一批制备的样品会总体上表达高于第二批制备的样品，假设所有样品表达值的范围和分布都应当相似，
#需要进行归一化来确保整个实验中每个样本的表达分布都相似。
#2.归一化要在log2标准化之前做


library(limma) 

exprSet=normalizeBetweenArrays(filtered_genes_2)

boxplot(exprSet,outline=FALSE, notch=T, las=2)  ##出箱线图

## 这步把矩阵转换为数据框很重要
class(exprSet)   ##注释：此时数据的格式是矩阵（Matrix）
exprSet <- as.data.frame(exprSet)


#标准化 表达矩阵自动log2化
qx <- as.numeric(quantile(exprSet, c(0., 0.25, 0.5, 0.75, 0.99, 1.0), na.rm=T))
LogC <- (qx[5] > 100) ||
  (qx[6]-qx[1] > 50 && qx[2] > 0) ||
  (qx[2] > 0 && qx[2] < 1 && qx[4] > 1 && qx[4] < 2)


## 开始判断
if (LogC) { 
  exprSet [which(exprSet  <= 0)] <- NaN
  ## 取log2
  exprSet_clean <- log2(exprSet)
  print("log2 transform finished")
}else{
  print("log2 transform not needed")
}

boxplot(exprSet_clean,outline=FALSE, notch=T, las=2)  ##出箱线图
### limma的函数归一化，矫正差异  ，表达矩阵自动log2化 得到exprSet_clean
#+==================================================================================
#+========================================================================================



# saving all data to the path
save(exprSet_clean, file ="exprSet_clean_75percent_filter.RData")

上述处理得到了干净的基因表达矩阵，数据部分已经没有问题，但是在做数据挖掘（差异分析、富集分析等）之前还有一项准备工作，要将数据样本进行分组，即患病组、对照组。