热休克蛋白家族A成员5（HSPA5）在内质网（ER）应激反应和未折叠蛋白应答（UPR）中起着关键作用，这两者对于细胞内蛋白质折叠、组装和质量控制至关重要。在ER应激的响应下，HSPA5会过度表达以维持细胞内稳态。先前的研究揭示了HSPA5表达与多种癌症之间的强关联。然而，HSPA5的预后功能及其在肿瘤形成中的作用仍然大部分未知。
1. 基因改变信息分析
cBioPortal工具显示，HSPA5基因变异具有显著的多样性和频率，UCEC、COAD、急性髓系白血病（AML）和睾丸生殖细胞肿瘤（TGCT）的突变率分别为4.73%、1%、0.67%和0.39%（图1A）。这些肿瘤显示出各种类型的突变。相比之下，肾脏嫌色细胞瘤（KICH）、食管腺癌（EAC）、低级胶质瘤（LGG）和肾脏肾乳头状细胞癌（KIRP）仅显示一种扩增类型，频率分别为1.54%、1.1%、0.97%和0.35%。其他肿瘤则显示两种或更多的变化类型。在各种肿瘤中，共鉴定出102个HSPA5的不确定意义变异（VUS）（图1B）。TCGA队列中HSPA5的转录表达，以及各种拷贝数和突变情况。
图1 特定TCGA肿瘤中的HSPA5基因突变
2. 基因表达分析
使用GTEx、Human Protein Atlas（HPA）和Functional Annotation of Mammalian Genome 5（FANTOM5）队列的数据，对各种健康器官、单个细胞类型和肿瘤中的HSPA5表达进行了比较。在正常组织中，骨髓表现出最高的HSPA5表达；然而，RNA组织特异性较低。在单细胞RNA和RNA癌症分类分析中，HSPA5表达显示出有限的细胞类型特异性和较弱的癌症特异性。
使用TCGA和GTEx数据库，对不同肿瘤类型中HSPA5的转录表达进行了检查。在33种常见肿瘤类型中，与相应的正常组织相比，HSPA5主要在26种肿瘤中表达（图2A）。然而，在急性髓系白血病（LAML）组织中，HSPA5的表达比健康组织更为普遍（P=0.001）。同样，在KICH、KIRP、肉瘤（SARC）和甲状腺乳头状癌（THCA）中，HSPA5的表达在正常和恶性组织之间相当。卵巢浆液性囊腺癌（OV）、结直肠腺癌（COAD）、子宫内膜癌（UCEC）、头颈部鳞状细胞癌（HNSC）、肺腺癌（LUAD）和肾透明细胞癌（KIRC）是HSPA5蛋白在肿瘤组织中明显升高的癌症类型（图2B）。图3展示了来自HPA数据库的BRCA、LIHC和COAD中HSPA5表达的免疫组化染色。
图2 各种肿瘤中HSPA5的表达
图3 三种肿瘤类型（COAD，LIHC和BRCA）在翻译水平上与其相应的正常组织（结肠，肝脏和乳房）相比，表现出不同水平的HSPA5表达
3. 生存分析
利用TCGA的数据，根据较高和较低的HSPA5表达水平分成了两组。已经在各种癌症类型中研究了HSPA5表达与患者预后的关系。在BRCA、宫颈鳞状细胞癌、子宫内膜腺癌（CESC）、胶质母细胞瘤（GBM）、HNSC、KIRP、LGG、LIHC、LUAD、SARC和葡萄膜黑色素瘤（UVM）等癌症中，过度表达HSPA5的患者显示出相对较低的生存率（图4，P < 0.05）。ACC、BLCA、CESC、食管癌（ESCA）、GBM、HNSC、KICH、KIRP、LGG、LIHC、肺鳞状细胞癌（LUSC）、胰腺腺癌（PAAD）、前列腺腺癌（PRAD）、SARC和UVM等高HSPA5表达的患者显示出较低的无病生存率（图4，所有P < 0.05）。在ACC、BLCA、CESC、淋巴组织肿瘤弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBC）、HNSC、KICH、肾透明细胞癌（KIRC）、KIRP、LGG、LUSC、PAAD、SARC和UVM中，高HSPA5表达与PFI相关（图4，P < 0.05）。选择了HNSC、KIRP、LGG和SARC四种代表性肿瘤的OS、DSS和PFI的Kaplan-Meier曲线。这些研究结果表明，HSPA5可能有助于各种肿瘤向恶性发展，并可能成为一种潜在的预测性生物标志物。
图4 HSPA5基因在肿瘤中的表达与TCGA中的生存预后之间的相关性
4. 基因富集分析
使用STRING程序，确定了与HSPA5相互作用的前50个蛋白质，并生成了一个蛋白质相互作用网络（图5A）。与HSPA5表达相关的前100个基因列在附表1中。将HSPA5相互作用和相关基因合并，并进行了KEGG通路和GO富集分析。根据KEGG通路分析，这些基因参与与前列腺癌和其他癌症相关的过程。HSPA5表达与动脉粥样硬化、肌萎缩性侧索硬化和其他神经退行性疾病密切相关。HSPA5对蛋白质的输出和基于内质网的蛋白质加工也至关重要（图5B）。
图5 HSPA5相关基因富集分析
GO富集分析显示，与HSPA5相互作用和相关的基因与生物过程（BP）类别的功能相关，如伴随体介导的自噬、应对内质网应激、高尔基小泡运输、应对拓扑错误蛋白、内质网到高尔基小泡介导的运输、应对未折叠蛋白以及应对错误折叠蛋白（图5C）。进一步分析表明，内膜系统与细胞组分（CC）类别中的含有内质网蛋白复合物之间存在强烈联系，并与HSPA5相关（图5D）。分子功能（MF）类别分析显示了HSPA5与多种分子结合能力之间的关系（图5E）。此外，GSEA分析显示了TCGA队列中HSPA5表达高的患者的基因表达谱与EGFR和BMI1等与癌症相关的基因之间的关系（图6）。
图6 HSPA5的致癌基因集富集分析
5. 免疫相关分析
使用四种算法（TIDE、XCELL、EPIC和MCPCOUNTER）检查了HSPA5表达与CAFs之间的关联。大多数算法显示出相似的模式，从而增加了研究结果的可信度。HSPA5表达与大多数肿瘤类型中的CAF浸润呈正相关，包括前列腺癌（PRAD）、胃腺癌（STAD）和甲状腺癌（THCA），但与头颈部鳞状细胞癌（HNSC）、肺鳞状细胞癌（LUSC）、低级别胶质瘤（LGG）、肺腺癌（LUAD）、结肠直肠癌（COAD）和胸腺瘤（THYM）中的CAF浸润呈负相关（图7A）。图7B显示了算法生成的代表性散点图。作者还研究了HSPA5表达与其他免疫细胞之间的关系。免疫细胞图包括25种不同类型的免疫细胞，包括经典活化巨噬细胞（M1）、替代性活化巨噬细胞（M2）和活跃的CD8+ T细胞。根据免疫图，HSPA5表达与膀胱癌（BLCA）、葡萄膜黑色素瘤（UVM）和乳腺癌（BRCA）的免疫细胞呈正相关，但与大多数胶质母细胞瘤（GBM）和甲状腺癌（THCA）的免疫细胞呈负相关。
图7 癌相关成纤维细胞（CAFs）与免疫细胞浸润以及HSPA5表达之间的关系分析
在线平台SangerBox被用来研究HSPA5表达与免疫浸润评分之间的关系。大多数包括的肿瘤在免疫评分、基质评分和ESTIMATE评分上显示出显著变化（图8A）。在LGG + GBM组中，泛肾癌队列（KICH + KIRC + KIRP）、膀胱癌（BLCA）和HSPA5与ESTIMATE评分、基质评分和免疫评分呈正相关。相反，它与急性髓性白血病（LAML）、肺腺癌（LUAD）、前列腺癌（PRAD）、胃癌（STAD）、胃食管癌（STES）、甲状腺癌（THCA）和子宫内膜癌（UCEC）呈负相关（p值<0.05；图8B-D）。
图8 HSPA5表达与免疫评分、基质评分和ESTIMATE评分之间的相关性分析
HSPA5在各种肿瘤中与大多数免疫检查点蛋白（ICPs）呈正相关，这一点可以通过ICP分析得到证实，包括UVM、OV、DLBC、BLCA、泛肾癌队列（KICH + KIRC + KIRP）、KIPAN、直肠腺癌（READ）、GBM + LGG、COAD、UCEC、THYM、LIHC、KIRC和KIRP。HSPA5与程序性细胞死亡蛋白-1（PDCD1，也称为PD-1）、CD152（细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4，通常称为CTLA4）和CD274在多种癌症中呈良好相关性，例如嗜铬细胞瘤和副神经节瘤（PCPG）、GBM、COAD和LIHC（也称为PD-L1）（图9）。单细胞数据显示，尽管HSPA5在不同细胞类型中的表达程度有所不同，但主要存在于免疫和恶性细胞中。HSPA5在胰腺导管腺癌（PDAC）、非小细胞肺癌（NSCLC）和GBM的恶性细胞中表达最高。
图9 免疫检查点（ICP）基因表达与HSPA5表达在某些癌症中相关
6. 实验验证
为了验证HSPA5在人类肿瘤组织中的表达以及其与免疫检查点蛋白的关系，作者验证了生物信息学预测。与非肿瘤乳腺和肝脏组织相比，作者观察到乳腺癌和肝癌患者的肿瘤组织中HSPA5和PD-L1的高表达（图10A）。作者使用免疫组化评分对结果进行了量化，发现在BRCA中，HSPA5的免疫组化评分为5.33，而PD-L1的评分为3.67。在对照组中，HSPA5的评分为1，PD-L1的评分为1.67。在LIHC组中，HSPA5的评分为6.33，PD-L1的评分为3.67；在对照组中，HSPA5的评分为2，PD-L1的评分为1.67（图10B）。作者的体外实验表明，敲除HSPA5会影响Hep3B细胞的增殖、侵袭和迁移能力。总之，实验结果与生物信息学预测基本一致。
图10 高表达的HSPA5和PD-L1在BRCA和LIHC中
总结
作者的研究呈现了对HSPA5表达的泛癌分析结果。这项调查是首次将HSPA5表达、预后、KEGG通路和GO富集分析、免疫评分、基质评分、估计评分、CAF和免疫检查点结合起来进行研究。这些发现已经通过患者标本进行了验证。总之，作者的结果表明，在大多数研究的癌症中，HSPA5作为一个癌基因发挥作用。HSPA5的过度表达可能导致各种类型的癌症预后不良，并为HSPA5的预后作用及其可能参与肿瘤发展提供了新的见解。
