今天给同学们分享一篇铜死亡+缺氧+分型+实验的生信文章“Unraveling Colorectal Cancer and Pan-cancer Immune Heterogeneity and Synthetic Therapy Response Using Cuproptosis and Hypoxia Regulators by Multi-omic Analysis and Experimental Validation”，这篇文章于2023年7月9日发表在Int J Biol Sci期刊上，影响因子为9.2。
铜死亡是一种新型的程序性细胞死亡（PCD），与细胞三羧酸循环和细胞呼吸密切相关，而缺氧可调节PCD。然而，它们对肿瘤亚型的综合贡献仍有待探索。在此，作者应用多组学方法，根据杯突和缺氧对 TCGA_COADREAD 进行了分类。该分类在三个结直肠癌（CRC）队列中得到了验证，并扩展到泛癌症分析中。
图1 研究流程图
1. 建立铜死亡-缺氧亚型
利用无监督聚类，根据与铜死亡和缺氧相关的关键基因，将TCGA_CADREAD患者分为三个群，即CHS1、CHS2和CHS3。CHS1 在铜死亡方面得分最高，在缺氧方面得分最低，而 CHS3 则相反。验证数据集的得分特征与训练集一致。CHS1 的分期较早，转移较少，而 CHS3 则呈相反趋势。不过，三个亚型在年龄和性别方面没有明显差异。
2. 突变特征
单核苷酸多态性（SNP）特征在 CHS 的前 10 个基因中呈现出差异（图A)。基因突变率差异很大，即使在它们之间共有的基因中也是如此。例如，在 54% 的 CHS1 中发现公认的癌基因 Kras 发生突变，而在 CHS3 中仅发现 3%。CRC 细胞中的 Kras 突变通过改变细胞内铜池来改变对铜生物利用率的需求。考虑到CHSs之间的铜死亡差异，Kras状态可能与CRC的铜死亡有关。作为 CRC 的一个不利预后因素，Braf 突变率在 CHS1 和 CHS3 中分别为 3.7% 和 17.3%，表明 CHS3 的预后较差（图2）。在验证集中，Kras 和 Braf 在 CHSs 中的突变倾向得到了验证（图2）。不同亚型的 SNP 类型比例也有所不同。
图2 CHS 的基因组特征
拷贝数变异（CNV）分析表明，不同 CHS 的异常扩增和缺失情况各不相同（图 2）。突变率结果 q < 0.05 的位点被保留用于 GO 富集分析。CHS1 中的基因座富集了循环免疫球蛋白、适应性免疫反应等。CHS2 的结果包括 mRNA 剪接和细胞对 INF_a 的反应，而 CHS3 的结果则包括脂质代谢和内源性细胞凋亡等（图3）。
3. 富集分析
作者根据特征标记30进行了GSVA，以描述CHS的特征。令人惊讶的是，几乎所有亚型之间的基因集都存在显著差异（图3A）。CHS3的细胞增殖、侵袭和转移、避免免疫破坏和诱导血管生成的能力更强，而CHS1的细胞逃避生长抑制和能量代谢失调的能力更强。在三个验证集中也观察到了相同的趋势。作者基于GO基因集进行了GSVA，以进一步分析多种一般生物学特征。如图所示图3B，3B，在增殖、血管生成、侵袭、干性和免疫方面存在差异，所有这些在CHS1和CHS3之间更为明显。
图3 CHS的代表性生物学特征
为了探索CHS1和CHS3之间的差异，作者首先进行了差异分析以识别DEG，在此基础上进行了GO分析。结果显示，DEGs主要富集在转移和免疫相关途径中（图3C）。此外，作者观察到具有经典生物学特征的代表性途径的GSEA在CHS3中更活跃（图3D），也验证了GSVA的结果（图3B）。在三个验证队列中，所有上述结果都呈现出与训练集相同的趋势。
一致分子亚型（CMS）可能是CRC最可靠的分类。它将患者分为4类，即具有高突变和免疫激活的CMS1；具有显著WNT和MYC信号激活的CMS2；CMS3，明显的代谢失调；和CMS4具有显著的TGF-β活化、基质细胞侵袭性血管生成和不良预后。如图所示图3E，3E，CHS1主要对应于CMS2和CMS3，CHS2没有倾向性分布，CHS3主要属于CMS4，这与CHS的标志性特征和预后特征一致。两个分类法的对应关系在验证队列中是相同的。
4. CHS的代谢概况
由于细胞代谢与铜死亡和缺氧有关，以及能量代谢在标志性分析中的意义，作者基于所有KEGG代谢途径进行了GSVA，以探索CHS的代谢谱。这表明，除聚糖外，CHS1中其他物质的代谢最为活跃。值得注意的是，与铜死亡密切相关的TCA循环和硫辛酸代谢在CHS1中更为活跃（图3F，3G），这对应于它们与铜死亡之间的生理关系。由于氧化磷酸化是TCA循环后有氧呼吸的关键步骤，作者还对氧化磷酸化进行了GSEA。结果表明，CHS1和CHS3的氧化磷酸化程度没有显著差异（p=0.705）。这与Tsvetkov等人的研究结果一致，表明铜对铜死亡的影响是通过TCA循环而不是直接靶向电子传输链。三个验证数据集的代谢分析结果与训练组的结果相似。
5. CHS的免疫景观
免疫系统充当重要的抗肿瘤屏障。CHS3中T细胞库（TCR）和B细胞库（BCR）的丰度和多样性较高，表明CHS3中有更多的T细胞和B细胞浸润。TIMER的结果显示，CHS中的六个主要免疫细胞亚型差异显著，并且在CHS3中最丰富（图4A）。EPIC的结果与TIMER基本一致。值得注意的是，CSH3中癌症相关成纤维细胞（CAFs）的比例也高得多（图4B），与特征标记和CMS结果一致。MCP计数器的结果也符合TIMER和EPIC。
图4 CHS的免疫状况
接下来，作者使用估计算法来评估TME的总体状态（图4C）。从ESTIMATE获得的三个指标在CSH3中最高，表明CHS3中的免疫细胞和基质成分相对更丰富。CHS3的肿瘤纯度最低，与估计得分呈阴性。验证队列的得分呈现出相同的趋势。作者测量了免疫检查点阻断（ICB）相关分子的表达，并观察到它们在CHS3中的表达最高（图4D）。高淋巴细胞分数也与ICB的更好疗效有关。分析表明，CHS3中的淋巴细胞分数也是最高的。ICB的效能直接受到TME41的影响。Fowler等人建立了Fges（功能性基因表达特征），将TME分为四种不同的亚型。分析表明，Fges在三种亚型中的特征是不同的（图4E）。
6. 在单细胞水平上检查亚型的特征
在注释了细胞类型后，作者从单细胞数据集中获得了2212个肿瘤细胞（图5A）。一些关键基因的表达显示出明显的差异。例如，铜死亡调节因子ATP7B和SLC31A1几乎只在肿瘤细胞中表达。相反，一些基因如SLC2A3和RORA在除肿瘤细胞外的其他细胞中高度表达。
图5 单细胞和有核梭杆菌分析
作者的分类器将肿瘤细胞分为三亚型，以观察生物学特征并验证大量转录组数据的结论。也就是说，CHS1中的TCA循环和硫辛酸代谢比CHS3更活跃。CHS3细胞的其他代表性特征比CHS1细胞更强（图5C-E）。
7. CHS人群DNA甲基化模式及微生物群特征
异常甲基化与肿瘤发生、细胞凋亡和治疗耐药性有关。CHS1和CHS3之间甲基化位点的比较显示了不同的甲基化位点。免疫和脂质代谢是基于差异位点的十大富集分析途径之一，从另一个维度验证了转录组分析结果的可靠性。
微生物群在CRC的起源、发展和治疗反应中的重要性已被逐渐认识到，尤其是有核梭杆菌（F.n）。CHS3中的F.n丰度显著较高（图5F）。TIGIT和BIRC3是与F.n相互作用的关键因素，可抑制CRC中的肿瘤免疫并促进化疗耐药性。LBP、MD2、TLR4和CD14负责一般细菌作用50。对上述基因的分析表明，它们在CHS3中的表达显著更高，与F.n的丰富性一致（图5G）。基于对细菌反应的基因集的GSEA显示，每条途径的p值都小于0.05（图5H）。这表明组织中的F.n可能改变多种信号通路的转导，从而影响CRC的肿瘤发生和进展。
8. 竞争性内源性RNA（ceRNA）网络的构建
Salmena等人提出了ceRNA的概念来描述不同类型ncRNA之间复杂的调控关系。最近发现，它们在各种疾病中都是不可忽视的，包括CRC 。作者对miRNA进行了差异分析，获得了150个差异表达的miRNA。富集分析表明，差异miRNA在JNK级联和干扰素-γ结合中富集。基于miRNA和lncRNA的差异，作者使用StarBase获得了10个中枢lncRNA和28个中枢miRNA。接下来，作者利用miRNA-mRNA预测网站获得409个靶向mRNA，并成功地用细胞镜可视化了ceNetwork。
9. 泛癌分析
鉴于铜死亡和缺氧都是非癌症特异性的，作者探讨了上述分类法是否适用于其他癌症。使用TCGA-COADREAD作为训练集，应用KNN对癌症进行分类。大多数肿瘤具有与CRC相同的评分特征——铜死亡评分在CHS1中最高，在CHS3中最低，而缺氧评分则相反（图6A）。
图6 泛癌细胞中CHS的经典生物学特征
10. 泛癌细胞特征图谱
由于CRC的特征在CHS之间存在显著差异，作者对特征进行了GSVA，以调查泛癌细胞的CHS是否具有相同的生物学特征。在几乎所有的癌症中，CHS3表现出更活跃的细胞增殖、转移、免疫破坏和血管生成，而CHS1具有更强的逃避生长抑制和能量代谢失调的能力（图6B）。此外，作者在泛癌细胞中进行了各种特定途径的GSVA。大多数癌症与CRC相同，CHS在增殖、干性、侵袭性、血管生成和免疫方面存在显著差异。上述差异在CHS1和CHS3之间更为明显。GSEA的结果与GSVA一致，即上述特征在CHS3中更为活跃（图7A）。
图7 泛癌3例CHS的免疫景观
11. 泛癌细胞的代谢特征
基于KEGG代谢途径的泛癌GSVA的代谢特征表明，大多数肿瘤的代谢特征与CRC的代谢特征具有相同的趋势——除了聚糖生物合成外，物质代谢在CHS1中最活跃（图6C）。病理类型为腺癌的癌症的特征与结直肠癌具有更高的相似性，突出了组织来源和病理类型的重要性。TCA循环的活性和脂肪酸代谢呈现出相似的趋势。这些结果表明CHS分类是肿瘤代谢的一个重要方面，尤其是腺癌。
12. 泛癌CHS的免疫景观
TIMER、EPIC和MCP-计数器用于评估全癌免疫细胞的浸润。作者发现，在大多数患有TIMER的癌症类型中，6种免疫细胞的CHS之间存在显著差异，趋势与CRC相同（图7B）。通过EPIC和MCP-计数器获得的结果也与CRC的结果相同。TCR和BCR的丰度和多样性显示出相同的趋势。根据估计评估，大多数癌症中免疫细胞和基质成分的浸润与CRC中每种亚型的浸润相似。与CRC一样，ICB相关分子在CHS中的表达最高，但在CHS1中最低。然后，作者根据Fges将泛癌TME分为四种亚型，并与CHS进行比较，其对应性与CRC一致。也就是说，大多数CHS1属于D亚型，CHS3属于IE/F或F亚型，这证实了CHS3中TME的高度纤维化（图7C）。
13. 聚类在临床应用中的探索
经典药物的敏感性和类器官验证为了评估CHSs的药物敏感性，作者从Drugbank检索了CRC药物的靶分子，并分析了它们在CHSs中的特异性表达。作者观察到CHS中化疗药物和靶向药物的多个靶点表达存在明显差异（图8A）。靶向分子在CHS3中的较高表达表明该亚型可能从药物中受益更多。
图8 聚类的临床应用
利用转录组学数据将类器官样本成功分类为CHS。类器官的IC50值与DrugBank的预测一致。CHS3对氟和SN38（体内伊立替康的活性形式）最敏感，而CHS1相对不敏感（图8B）。根据临床疗效，CSH3患者确实从化疗中获益更多（图8C）。对GSE28702的分析还表明，CHS3对FOLFOX的反应率最高。总之，这些结果表明，这种分类法在指导临床用药方面是有价值的。
14. 新药预测与细胞验证
使用cMap数据库，作者确定了五种针对CHS1和CHS3的强效药物，并分析了这些药物与关键基因之间的相关性。为了测试疗效，作者用药物治疗了属于不同CHS的CRC细胞系，但马索前列醇除外。作者选择LS180、HT29和HCT116、SW620细胞分别代表CHS1和CHS3。CHS1和CHS3细胞之间代表性关键基因的表达在转录水平和蛋白质水平上是不同的。IC50结果显示，除毛喉素、帕唑帕尼和MK-0752外，大多数药物对CRC细胞具有较强的细胞杀伤作用（图S18）。在其余药物中，大多数细胞系的IC50与预测趋势一致——对CHS3敏感的药物在HCT116和SW620中的IC50值较低，而对CHS1敏感的药物则呈现相反的趋势（图8D）。transwell测定显示，大多数药物对两种细胞亚型的迁移具有有效和不同的影响（图8E，F）。对CHS3敏感的药物在更大程度上削弱了HCT116和SW620的迁移能力。菌落形成呈现出类似的趋势（图8G、H）。一般来说，马西替尼对CHS1细胞的增殖、迁移和存活具有更明显的影响，这表明马西替尼可能对CHS1具有意想不到的抗肿瘤作用。类似地，对CHS3应用辛伐他汀。
15. 聚类的预测价值
训练集的生存分析表明，CHS的结果有显著差异。CHS1的预后最好，而CHS3的预后最差（图8I）。在验证集中观察到相同的生存趋势（图8J）。这也与Braf突变的指示一致（图2B）。
作者根据CHS1和CHS3之间的预后差异构建了一个预后模型。得分较高的患者预后较差。此外，作者用该模型建立了一个列线图，用于临床应用。1年、3年和5年的时间依赖ROC曲线的曲线下面积分别为0.8、0.8和0.81。最后，作者构建了校准曲线，以测试预测生存概率和实际信息的一致性。ROC和校准曲线都验证了该模型的良好预测性能。
总结
总之，作者根据铜死亡和缺氧对CRC进行了多组学分析，将患者分为三种特征明确的亚型。分型算法适用于泛癌，每个CHS的一般生物学过程和免疫特征在泛癌患者中相似。对于CRC，化疗和靶向治疗对CHS3更有效，改善缺氧可能会进一步促进这些作用。对于大多数泛癌病例，在抗纤维化和抗缺氧条件下，CHS3可能从ICB治疗中受益匪浅。
