2022年8月，凌恩生物客户河海大学罗景阳教授团队在《Science of the Total Environment》期刊上发表研究论文“Para-chloro-meta-xylenol reshaped the fates of antibiotic resistance genes during sludge fermentation: Insights of cell membrane permeability, bacterial structure and biological pathways”，主要研究了对氯间二甲苯酚（PCMX）对剩余活性污泥（WAS）厌氧发酵过程中抗生素抗性基因（ARGs）传播的环境风险，并揭示了其中的关键机制。

期刊：Science of the Total Environment         

影响因子：10.753          

发表时间：2022

样本类型：剩余活性污泥

客户单位：河海大学

一、研究背景

在剩余活性污泥（WAS）中出现对氯间二甲苯酚（PCMX，主要消耗抗菌化学品）将对WAS的利用构成环境风险。PCMX能够干扰细菌的增殖和细胞代谢，因此，迫切需要研究PCMX胁迫与ARGs之间的内在机制。

二、实验设计

本研究在中国南京市废水处理厂的一个二次沉淀池收集剩余活性污泥（WAS）样品，通过宏基因组测序分析了不同分组下对氯间二甲苯酚（PCMX）对WAS厌氧发酵过程中抗生素抗性基因(ARGs)的丰度，以及ARGs、MGEs和微生物群落结构的变化。

图1 实验设计

三、研究结果

1、宏基因组学显示了PCMX胁迫后ARGs丰度的变化

PCMX明显影响了WAS发酵过程中ARGs的多样性和丰度。与对照组相比，在低PCMX胁迫和高PCMX胁迫的反应器中，总ARGs亚型从对照组的154个亚型增加到203和208个，且总体ARGs丰度分别增加了5.7和17.6%（图2（a））。其中，多药类基因是对照组中主要的ARGs类型，并在PCMX胁迫下进一步改善。特别是多药类基因adeJ和emrA的相对丰度从对照的0.03和0.16‰增加到0.06和0.61‰（图2（b））。

PCMX显著诱导了厌氧发酵过程中ARGs丰度和多样性的增加（尤其是与多药合用的ARGs），其作用具有高度的剂量依赖性。

 图2 （a）PCMX胁迫对总ARGs相对丰度的影响，（b）对ARGs类型相对丰度的影响（‰）和（c）PCMX对不同抗性机制ARGs分布的影响（%）

2、MGEs分布模式的变化

如图3（a）所示，在对照组、低PCMX和高PCMX样本中分别鉴定出44、51和58个MGEs亚型（图3（b）），在所有样本中检测到的转座酶是主要的MGEs类型（图3（b））。在对照反应器中，转座酶的丰度仅为0.29个拷贝/16S rRNA，然而，在低PCMX和高PCMX反应器中，上升到0.33和0.46个拷贝数（图3（c））。

PCMX显著诱导了MGEs丰度（特别是转座酶）的增加，提高了厌氧发酵系统中ARGs基因水平转移的概率。

 图3 （a）在存在或不存在PCMX胁迫的情况下检测到的MGEs亚型数量，（b）PCMX胁迫对总MGEs的相对丰富的影响，（c）PCMX胁迫下WAS中MGEs类型的丰度和（d）典型MGEs亚型的丰度

3、PCMX提高了ARGs传播的细胞膜通透性

LDH释放是评估细菌膜破坏程度的常用指标，在低PCMX下增加了15.8倍，在高PCMX反应器下增加到50.8倍（图4（b））。与对照组相比（即对照反应器中的84 mg/L和24 mg/L），PCMX的存在使EPS中可溶性蛋白和碳水化合物的浓度分别增加了5.5倍和15.3倍、4.8倍和6.7倍（图4（b））。

PCMX引起的细胞膜通透性增强可以进一步证实细胞膜转运的相对丰度，在对照组、低PCMX和高PCMX反应器中分别为3.5、3.6和3.7%（图4（d））。

综上所述，PCMX有效地破坏了微生物的保护屏障，增加了细胞通透性，这是促进细菌群落中ARGs和MGEs HGT的主要原因之一。

图4 （a）不同PCMX剂量下WAS中LDH的相对丰度和（b）可溶性底物浓度，（c）PCMX对结合DNA转移的IV型分泌系统说明的影响和（d）基于KEGG分类的功能基因的相对丰度

4、PCMX胁迫下细菌群落结构的变化及与ARGs和MGEs的共发生网络

在PCMX胁迫下，WAS发酵系统整体微生物多样性和丰富度的Chao和Shannan指数发生了明显变化（图5（a））。从属水平上的微生物群落来看，不同剂量PCMX下与ARGs相关的属大部分都与相应系统中ARGs剧增的趋势相一致（图5（c））。

相关性分析表明，ARGs类型与42个细菌属相关，多药型基因与Dyella、Erythrobacter和Sphingomonas等属呈强正相关，说明多药型ARGs比其他ARG更容易受到细菌群落变化的影响（图5（d））。

微生物群落变化和共发生网络分析表明，PCMX提高了潜在ARGs宿主的相对丰度（主要与多药耐药机制相关），并有利于MGEs和细菌宿主对厌氧发酵系统中ARGs增殖的共同作用。

图5 （a）Chao和Shannon指数，主要微生物在门水平（b）和（c）属水平的变化，（d）共发生网络分析ARGs、MGEs和细菌属之间的共存，（e）ARGs和MGEs丰度之间的相关性分析

5、与ARGs传播相关的代谢途径和遗传表达调控

相关研究证明，ARGs的传播高度依赖于相关的生物学途径。进一步分析发现，PCMX显著富集了与多药耐药和ATP结合盒（ABC）转运蛋白功能相关的KO，且效果呈剂量依赖性。在低PCMX和高PCMX反应器中，其丰度分别从对照组的1.45和1.38‰增加到1.90和1.67‰、2.21和2.10‰。此外，与双组分系统（TCS）相关的重要编码基因在PCMX应力反应器中显著富集（图6（b））。PCMX显著上调了与群体感应（QS）系统相关的基因的表达，并且变异模式与ARGs丰度的增加一致（图6（b））。总之，PCMX诱导的这些途径的调控最终导致了WAS发酵过程中ARGs的传播。

图6 （a）不同PCMX用量下代谢途径的前40位相对丰度（‰）和（b）PCMX对双组分系统和群体感应系统中典型基因表达的影响(‰)

6、由PCMX诱导的ARGs传播的主要影响因素及其潜在的环境影响

如图7所示，方差分解分析（VPA）表明，MGEs、细菌群落和相关基因的表达分别占ARGs总变异的12.91、64.11和6.86 %。显然，细菌群落结构是影响WAS发酵过程中ARGs传播的主要因素。此外，细菌群落与其他因素之间的相互作用也在ARGs增殖中发挥了关键作用。与基因表达相比，PCMX引起的不同MGEs因子对细菌群落结构有显著影响。该研究表明环境水平的PCMX可以明显促进ARGs在WAS厌氧发酵系统中的传播。

图7 MGEs、细菌群落和ARGs传播相关基因表达之间关系的方差分解分析（VPA）分析

四、研究结论

综上所述，本研究表明PMCX促进了ARGs的传播，并且效果是剂量依赖性的。PCMX起ARGs传播的功能机制主要归因于MGEs的增加、潜在的ARGs宿主和相关的抗性代谢途径。本研究为外源污染物对WAS中ARGs传播扩散及风险的影响开拓了新的思路，以期在实践中指导ARGs和PCMX的控制和管理，从而在实现WAS资源化的同时控制安全风险。

参考文献

Para-chloro-meta-xylenol reshaped the fates of antibiotic resistance genes during sludge fermentation: Insights of cell membrane permeability, bacterial structure and biological pathways. Science of the Total Environment, 2022.