文章目录

第四章 DNA的生物合成
- 第一节 DNA复制的一般特征
- - 1 DNA的半保留复制
  - 2 DNA的双向复制
  - 3 DNA的半不连续复制
- 第二节 DNA复制的酶学
- - 1 DNA聚合酶
  - - 1.1 原核生物DNA pol
    - - 1.1.1 DNA pol I
      - 1.2 DNA pol II
      - 1.3 DNA pol III
      - 1.4 其它的DNA pol
    - 1.2 真核生物DNA聚合酶
  - 2 DNA解螺旋酶
  - - 2.1 大肠杆菌中的解螺旋酶
  - 3 SSB
  - 4 DNA 拓扑异构酶
  - 5 DNA引发酶
  - 6 DNA 连接酶
- 第三节 DNA复制的详细机制
- - 1 复制的起始
  - 2 复制的延伸
  - 3 复制的终止
  - 4 冈崎片段的连接
  - 5 端粒和端粒酶

第四章 DNA的生物合成

第一节 DNA复制的一般特征

先介绍一些乱七八糟的知识

总共是三个特征，并介绍了一下相关的实验

1 DNA的半保留复制

经典实验：同位素标记，大肠杆菌实验

假设三种复制方式

实验结果

实验2

名词解释

DNA复制
亲代双链DNA分子在DNA聚合酶的作用下，分别以每条单链 DNA分子为模板，聚合与自身碱基可以互补配对的游离的dNTP，合成出两条与亲代DNA分子完全相同的子代DNA分子的过程。

2 DNA的双向复制

复制从DNA分子的特定位置开始：
- 复制起点/复制原点 (origin, O)；
能够独立进行复制的基因组单位：
- 复制子(replicon)
- 一个复制子只含有一个复制起点
DNA链从5’一3‘延伸；

复制起始的多种方式

枯草杆菌实验
动物DNA实验
原核生物：多复制叉：在一轮复制还没结束的时候，复制起点直接进行新一轮的复制

真核生物：多复制子，DNA复制过程中有多个复制起点

特殊复制方式
- 完全单向
- 滚环复制
- D环复制

3 DNA的半不连续复制

讲了一个经典实验

一条链连续合成，一条链不连续合成

第二节 DNA复制的酶学

DNA的复制需要多种酶和蛋白质的参与；
这些酶和蛋自质在复制叉处组装成复合物、负责DNA的合成，称为复制体 (replisome)
ome结尾的一般都是指一些复合物
在这里主要讲六大类参与DNA复制的酶

1 DNA聚合酶

DNA polymerase/DNA pol
DNA dependent/directed DNA poly merase
DDDPase

以DNA为模版来合成DNA

特殊之处
- 必须要有模版
- 它不能从头合成，要有引物（与RNA聚合酶差别之一）
在原核和真核生物之间的区别

1.1 原核生物DNA pol

E.coli DNA 聚合酶：
DNA pol
DNA pol I

DNA pol ll
DNA pol lv
DNA pol V

1.1.1 DNA pol I

这个酶（DNA pol I）有很多种酶活性，以下三种最为重要（不仅有合成DNA的活性，还有水解DNA的活性）
多功能酶
3’ to 5’ exonuclease activity（3’ 核酸外切酶）
5‘ to 3" exonuclease activity（5’ 核酸外切酶）
5 to 3’ DNA polymerizing activity（DNA聚合酶）
聚合酶和3’外切酶共同作用，可以有校对作用（碱基配对出错时，改正，大多数DNA聚合酶都有的。与RNA聚合酶差别之二）
KLENOW酶的二级结构
- 像一个手，可以结合DNA链
- 上面是聚合酶活性。下面是3‘外切酶活性。
  - 出错的时候，3‘外切酶活性会被激活，聚合酶活性被抑制
  - 正常延伸的时候，聚合酶活性会被激活，3‘外切酶活性被抑制
  - 交替活动，形成校对作用
实际上，所有DNA聚合酶、RNA聚合酶的三维结构
都相似，由finger、palm、thumb三个结构域组成。
原核、真核、病毒的核酸聚合酶在这三个结构域的
序列和结构具有高度的保守性。
再讲一下5’ 核酸外切酶
- 刚才3’ 核酸外切酶只能从3’端开始一个一个核苷酸的切，且要是单链状态下的DNA，而5’ 核酸外切酶可以一个一个切，也可以一段一段切，且可以是单链状态也可以是互补配对状态
- 切刻平移
- 缺口填补
两种酶活性对比
DNA Polymerasel 在DNA复制中的作用
- 实验发现其进行性（一旦结合能复制的长度）不高
- 无法只靠这个酶就完成DNA复制
一系列研究发现其不是最主要的DNA聚合酶
DNA poll的主要生物功能
- DNA损伤修复(E.coli突变菌株 poIA-对UV非常敏感);
- Nick translation;
- Gap fill-in;
- Short lengths of DNA synthesis

1.2 DNA pol II

1970年分离得到；
聚合酶活性：2400 base/min；
100分子/cell;
有3’一5’核酸外切酶活性，没有5’一3’核酸外切酶活性；
在DNA repair 中起作用；

1.3 DNA pol III

1971年分离
多亚基；
聚合酶活性是DNA pol l的50倍;50,000base/min
10-20分子/cell;
有3’一5’核酸外切酶活性没有5’一3’核酸外切酶活性；
高进行性；
这个酶才是重要发挥重要的，但是其含量低（导致发现的晚），活性高
结构
- 三个亚基靠 $\tau$ 亚基结合成一个核心酶，一个酶里有两个核心酶
- 钳载复合物：主要是帮 $\beta$ 亚基。装到模版链上和从模版链上解下来
- 复制的地方只要一分子聚合酶3就够了，包含两个核心酶，各自负责一个子代的合成。
- 这两个核心酶通过 $\tau$ 了连在一起，说明其移动方向一样。但是两条模版链的复制方向不一样，必须是5‘到3’，那该怎么解决呢。
  - 靠一个机制（后面会详细讲），可以看到图中下面那条DNA链是折回来的。以保证移动方向跟链的复制方向一致
聚合酶活性：
- DNA pol I holoenzyme催化DNA合成的速度在体外实验中可以达到700 nt/sec (E.coli 中DNA的合成速度是1000 nt/sec)
进行性：
- 在体外实验中，pol III的进行性可达 30 kb.
E.Col的一种温度敏感型突变菌株，在30度以卡可以正常生存，但是温度升高到45度时就难以生存；
- 原因：该菌株的polC基因 (DNApol ul a亚基）发生突变，在30度以下酶活性正常，在温度超过30度以后很容易变性失活；
证明DNA pol lll是E.coli（大肠杆菌）中真正的复制酶！
- II是参与DNA损伤修复、I主要是损伤修复，也参与复制

1.4 其它的DNA pol

DNA pol IV 和DNA polV
1999年发现
易错的 (error-prone）聚合酶
在DNA损伤修复中起作用；
DNA pol Iv在细菌生长稳定期表达；
DNApol V在SOS反应时表达；

1.2 真核生物DNA聚合酶

包括以下五种

1.2.1 DNA pol $\alpha$

具有引发酶活性，负责合成RNA引物；
没有3’外切酶活性（无校对作用）(因为其主要是负责引物的合成，可以理解)
在复制起始区，先合成短的RNA引物（约10 Nt)再合成20~30 Nt的DNA，然后被pol8 和s取代：

1.2.2 DNA pol $\beta$

损伤修复
DNA repair
最小的DNA pol;
进行性极低：
没有3"外切酶活性

1.2.3 DNA pol $\gamma$

在线粒体基质中发现；负责线粒体DNA的合成；
有3"外切酶活性；

1.2.4 DNA pol $\delta$

内在进行性低，但是有PCNA存在时进行性增加40倍，大大高于pola；
PCNA ( proliferating cell nuclear antigen）的一级结构与E.coli DNA pol 川的p亚基不同，但yeast PCNA三聚体结构与 $\beta$ clamp非常相似;
有3"外切酶活性；

1.2.5 DNA pol $\xi$

内在进行性高：
有3’外切酶活性：

2 DNA解螺旋酶

原核生物和真核生物都有多种解螺旋酶；
促进DNA双链解开；
结合DNA：与碱基序列无关；多数优先结合单链区；
结合NTP：具有内在的依赖于DNA的 NTPase活性；水解NTP为解链提供能量；多数优先结合或只能结合ATP；
具有移位酶活性：沿着所结合的DNA单向移动，速度可达1000 nt/s;
解链酶的极性：3’解链酶，5’解链酶，双极性酶；到底哪一种才是真正参与解螺旋的呢

2.1 大肠杆菌中的解螺旋酶

最先在E.col中发现的三种解螺旋酶：rep helicase, helicase II、III，并未参与DNA复制。
从温度敏感型E.col中分离得到的DnaB才是在复制叉处解开DNA双链的解螺旋酶。
实验

3 SSB

单链DNA结合蛋白

SSB, single-strand binding protein

选择性地与单链DNA结合：
防止单链DNA重新形成双链：
防止单链DNA的降解：
原核生物的SSB与单链DNA的结合具有协同性：
对于真核生物的SSB了解较少：已知一些真核生物病毒的DNA复制需要SSB的参与。
对原核生物的SSB了解比较多，SSB可以解螺旋后提供比较稳定的状态

4 DNA 拓扑异构酶

在复制前应该就发挥作用

复制叉的前进会带来额外的DNA扭曲张力（正超螺旋）
这种张力必需得到持续的释放，否则将最终影响DNA的复制。

分类
- Type l：催化DNA的一条链发生断製和再连接，不需要能量
  - 切开，红线到了蓝线后面，减少了一次缠绕
- Type II: 催化DNA的两条健同时发生断裂和再连接，需要要ATP提供能量：
  - 切了两条链
根据发现的顺序，我们命名为拓扑异构酶1、拓扑异构酶2、拓扑异构酶3，而类型1、2是根据原理来的，所以拓扑异构酶1可能是type1也可能是type2，这两个要分清楚
E.coli 依靠 DNA gyrase (type II topoisomerase
- 负责在复制过程中、在复制叉前消除由于复制叉前进
  带来的扭曲张力：消除正超螺旋、引入负超螺旋；
- DNA gyrase: $A_{2}B_{2}$
真核生物中由拓扑异构酶I负责清除复制叉前进带来的正超螺旋。

5 DNA引发酶

回顾：解螺旋酶消除张力，由解螺旋酶解开DNA，SSB结合到解开的单链上保护它，是不是下面就应该DNA聚合酶上去干活了呢

我们还需要引物，引物的合成需要特定的酶

DNA的合成必需要有引物；
合成引物的酶称为：引发酶
(primase)
合成引物的过程称为：引发
(priming)；
两条子链的合成都需要引发；
引物都是10-12 nt 的RNA；

实验
- 怎么证明引物是RNA而不是DNA?
- 怎么证明引物的长度？
实际上，包括大肠杆菌在内的多数原校生物不会利用自身的RNA聚合酶来合成引物，而是通过专门的酶系来完成引物的合成（一个复合物）。

E.coli 及其大多数噬菌体使用 Dna G 为 primase:
但合成引物还需要多种蛋白质的参与：
这些蛋白质组裝成预引发体：
预引发体与引发酶组装成引发体；
由引发体负责引物的合成。

6 DNA 连接酶

1967年发现：
催化一条链的5’-磷酸末端与另一条链的3’-OH末端之间形成磷酸二酯健。
只能连接处于nick状态的双链DNA，不能连接游离的两条单链DNA。

第三节 DNA复制的详细机制

1 复制的起始

复制原点的特征（原核、真核）
DNA复制原点富含AT碱基对，更容易出现所谓呼吸现象”，即氢键迅速断裂与再生，导致DNA两条链不断解链与聚合、形成瞬间的单链泡状结构。
DNA结合蛋白与复制原点处富含AT碱基对的重复序列的相互作用，促进了DNA复制的起始。
大肠杆菌、真核生物、酵母
- 不同的复制起始区各有特点

2 复制的延伸

原核生物中主要依靠DNA pol III负责复制过程中DNA链的延伸；
真核生物中主要依靠DNA pol $\delta$ 负责复制过程中DNA链的延伸；
原核生物DNA复制的延伸

$\beta$ 推动酶沿着模版链滑动

取决于三者的相互作用

真核生物DNA复制的延伸

3 复制的终止

滚环复制

DNA上存在一些位点、与DNA复制的终止有关

需要依靠拓扑异构酶去环化

4 冈崎片段的连接

DNA聚合酶和连接酶共同完成

5 端粒和端粒酶

对于真核生物来讲，真核生物的DNA合成面临末端（5‘端）菱缩的问题。

原核双链环状没有问题，而真核是双链线状

每复制一次，5‘端会少掉一点，虽然真核生物DNA5’端是无用的序列（冗余序列，其实就是端粒），但是总有一定减少的限制，所以真核生物细胞复制的轮数是有限的（当然实际情况更复杂，很多时候是中间有多个复制起点）

端粒和端粒酶：
- Telomere and telomerase
- 端粒：真核生物染色体末端、短的、富含GC的重复序列：
- 端粒酶：在DNA末端添加端粒序列的酶；
  - 端粒序列具有种属特异性：
  - tetrahymena:
    TTGGGG
    AACCCC
  - vertebrates(human)： TTAGGG
    AATCCC
端粒酶本质上是逆转录酶