miRNA 在基因调控中的作用

news2024/12/24 21:40:56

MicroRNA (miRNA) 是什么?“micro”“mi”是微小的意思,顾名思义,miRNA 就是小的非编码 RNA,长度约 23 个核苷酸 (nt),它在转录后的基因调控中发挥关键作用,包括疾病的发生、细胞分化与组织发育,细胞凋亡等等。


 

miRNA 的生物发生及在疾病中的作用




miRNA 从哪儿来:一般而言,在细胞核内,通过 RNA 聚合酶 Ⅱ 转录生成初始 miRNA (pri-miRNA),长约几百到几千个碱基不等。pri-miRNA 主要包括帽子结构和 poly(A),以及一个或多个发夹茎环结构 (Stem-loop) → 被 RNA 结合蛋白 DGCR8 高效特异性识别,并在 Drosha 蛋白的作用下,被切割成 ~70 nt 的茎环结构,即 miRNA 的前体 (pre-miRNA) →→ 在输出蛋白 Exportin5 的作用下运输到细胞质中,在 RNA 酶 Ⅲ 内切酶 Dicer 和 TRBP(反式激活应答 RNA 结合蛋白)伴侣的作用下形成 19-23 nt 左右的成熟双链 miRNA 结构 (引导链 miRNA 和随从链 miRNA*)  →→ 与 Argonaute (Ago) 蛋白和 Dicer 酶一起构成 RNA 诱导沉默复合体 (RNA-induced silencing complex, RISC),其中随从链 miRNA* 被移除,从而形成单链的 miRNA

miRNA 要到哪儿去:miRNA 的种子区域 (5’ 端的 2-8 nt) 通过序列互补原则靶向 mRNA,可直接抑制翻译,或可导致 mRNA 不稳定,从而降解靶蛋白。

(Ago 是 miRNA 的得力助手和保镖,miRNA 调控靶蛋白需要通过 Ago 实现,Ago 还保护了 miRNA 不被降解。以 hAgo 为例,hAgo 有四个亚型 hAgo1-hAgo4,Ago 通过 miRNA 的引导,定位到靶 mRNA 的互补区域,hAgo2 通过固有的内切核酸裂解活性来使 mRNA 沉默。或者更典型地,通过抑制翻译,以及诱导 mRNA 降解来发挥作用。)
 

图 1. miRNA 的生物发生过程 [2]


作为最早发现、名字都很独树一帜的 miRNA,let-7 一直以来都是 miRNA 研究中的常客,let-7 是个抑癌因子 (通过下调 MYC、HMGA2、BLIMP1 或者 RAS 家族成员,抑制肿瘤的发展),降低了癌症的侵袭性、化疗抗性和放射抗性 (极少数情况下,也可能作为一个原癌基因)。此外,let-7 还在诸多癌症中差异性表达,有望成为肿瘤筛选的标记物。

另一个流量明星——miR-210,是一个原癌 miRNA,在多种癌细胞中表达显著升高,如胰腺癌、乳腺癌。研究发现,沉默 miR-210-3p 可以显著抑制临床前模型中前列腺癌细胞的骨转移,miR-210-3p 通过靶向 NF-κB 信号通路的负调控因子 TNIP1 和  SOCS1 促进 EMT (间充质转化)、侵袭和迁移,导致 NF-κB 通路的激活。此外,miR-210 是低氧诱导因子的一个重要靶点,已有研究证实,高水平的 miR-210 和体内缺氧信号有关。

 

RNA 的二级结构也可成为小分子靶点?


第一个靶向 miRNA 的小分子得追溯到 2008 年,Shan 等人通过荧光标签筛选 FDA 库,发现依诺沙星 (Enoxacin) 可增强 siRNA 介导的 mRNA 降解,能促进内源性 miRNAs 的生物发生,该作用依赖于 TRBP 途径。但因 miRNA 的特殊性,不少小分子都是靶向 AGO、TRBP 等调控 miRNA 生物发生的关键分子,而非直接靶向。可喜的是,近年,研究人员发现了可靶向 RNA 二级结构的小分子。

2017 年,Matthew G. Costales 等人发现了 miR-210 的一个靶向小分子 Targapremir-210 (TGP-210),TGP-210 选择性的识别 miR-210 前体 pre-miRNA,并结合到该前体结构的 Dicer 位点,抑制 miRNA 的成熟,从而解除 miR-210 对缺氧相关蛋白 GPD1L 活性的抑制,引发一系列的生物学反应。
 

图 2. TGP-210 的作用机制 [7]


TGP-210 在纳摩尔级别就具有明显的促乳腺癌细胞凋亡作用,并通过 anti-miR-210 antagomir (miR-210 拮抗剂) 阳性对照实验发现,TGP-210 和 miR-210 拮抗剂具有相似的生物活性和特异性。
(TGP-210 和 miR-210 拮抗剂均影响成熟 miR-210 的表达水平,TGP-210 对其它  ~2500 个 miRNA 无明显活性。另外贴心地给大家比对了人、小鼠和大鼠的 pre-miR-210 的序列,发现其成熟 miRNA 序列完全一致,pre-miRNA 序列的同源性也高达 96.6%。)
 

图 3. 不同物种 pre-miR-210 的序列比对 (来自数据库 miRBase)


此外,在小鼠三阴性乳腺癌 (TNBC) 模型中,TGP-210 和 miR-210 拮抗剂均显著抑制了肿瘤生长,且 TGP-210 单次腹腔注射可维持肿瘤抑制 21 天。这些结果说明,能折叠成确定的二级结构,但三级结构有限的 RNA 也可以作为小分子的靶标,且小分子抑制剂显示出了意想不到的特异性。

 

TGP-210 的 2.0 版本——核糖核酸酶靶向嵌合物 (RIBOTAC)




研究不止步于此,Matthew G. Costales 团队在 2018 年报道,2-5 poly(A) 寡核苷酸偶联在 miR-96 的发夹前体结构上,可局部激活内源性的核糖核酸酶 (RNase L),在细胞中选择性切割 miR-96 的前体。miR-96 的沉默可以抑制促进 FOXO1 降解的转录因子,从而触发癌细胞的凋亡。无独有偶,该团队在 2020 年报道了 TGP-210 的后续研究,作者将不同单位的 2-5 poly(A) (1-4) 寡核苷酸偶联到 TGP-210  上,发现 TGP-210-RL (连接 4 个单位的 2-5A) 具有很好的切割活性 (RIBOTAC)。

图 4. TGP-210 和 TGP-210-RL 的结构式比较 [10]


TGP-210 可结合 pre-miRNA (Kd = 160 nM),但也能结合 DNA (Kd = 620 nM),而优化后的 TGP-210-RL 与 DNA 的结合活性大大降低 (Kd = 1200 nM),且具有更高的特异性,但其与 pre-miRNA 的结合活性也有所降低 (Kd = 320 nM)。

(Dicer 位点发生单碱基突变后,无法与 TGP-210-RL 结合。)

尽管有寡核苷酸的存在,TGP-210-RL 还是可以自如地进入细胞发挥作用 (进入数量是 TGP-210 的 60%),与 TGP-210 主要定位于细胞核不同,TGP-210-RL 主要存在于细胞质。TGP-210 和 TGP-210-RL 均可以显著下调成熟 miRNA 的水平。TGP-210-RL 同时显著下调 pre-miR-210 的水平,这是 TGP-210-RL 激活的 RNase L 选择性切割 pre-miR-210 的结果。和阳性对照 LNA-210 相比,TGP-210 和 TGP-210-RL 均可引起相似的癌细胞凋亡作用,且 TGP-210-RL 活性更好。

(TGP-210 会导致 pre-miR-210 的水平升高,这与其机制是一致的。过表达 miR-210 后,LNA-210、TGP-210 和 TGP-210-RL 的凋亡作用均消失,进一步验证了癌细胞凋亡是由抑制 miR-210 导致的。)

2020 年 12 月 Science 报道了 miRNA 靶向降解 (TDMD) 的新机制,研究发现 ZSWIM8 Cullin-RING E3 蛋白酶体途径靶向降解 Ago,使大量 miRNA 暴露降解。这一发现不仅为开发 miRNA 的降解剂提供了新思路,也拉近了 miRNA 和小分子药物的距离。

小编寄语:传统意义上认为的 RNA 难以靶向、药物筛选成本巨大等问题,常常使得 RNA 靶向小分子被忽略。但是 Matthew G. Costales 团队的研究给了我们新启示,一方面 Inforna 的计算程序可更好的评估小分子靶向 RNA 的选择性和靶向性,另一方面,核糖核酸酶靶向嵌合物(TGP-210-RL,RIBOTACs)也实现了新突破。2020 年 12 月,该团队又又又开发出了pre-miR-21 的小分子抑制剂 TGP-21 和 RIBOTAC TGP-21-C1-3,真是高效的团队,这速度小编实在望尘莫及。
 

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参考文献
1. Hongyu Liu, et al. Nuclear functions of mammalian MicroRNAs in gene regulation, immunity and cancer. Mol Cancer. 2018 Feb 22; 17(1): 64.
2. Dónal O'Carroll, et al. General principals of miRNA biogenesis and regulation in the brain. Neuropsychopharmacology. 2013 Jan; 38(1): 39-54.
3. Jessica Sheu-Gruttadauria, et al. Structural Basis for Target-Directed MicroRNA Degradation. Mol Cell. 2019 Sep 19; 75(6): 1243-1255. e7.
4. Evgeny Chirshev, et al. Let-7 as biomarker, prognostic indicator, and therapy for precision medicine in cancer. Clin Transl Med. 2019 Aug 28; 8(1): 24.
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9. Matthew G Costales, et al. Small Molecule Targeted Recruitment of a Nuclease to RNA. J Am Chem Soc. 2018 Jun 6; 140(22): 6741-6744.
10. Matthew G Costales, et al. Targeted Degradation of a Hypoxia-Associated Non-coding RNA Enhances the Selectivity of a Small Molecule Interacting with RNA. Cell Chem Biol. 2019 Aug 15; 26(8): 1180-1186. e5.
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12. Matthew D Disney, et al. Inforna 2.0: A Platform for the Sequence-Based Design of Small Molecules Targeting Structured RNAs. ACS Chem Biol. 2016 Jun 17; 11(6): 1720-8. 
13. Blessy M Suresh, et al. A general fragment-based approach to identify and optimize bioactive ligands targeting RNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 2020 Dec 29;117(52):33197-33203

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