新型昆虫病原菌假单胞菌的富集增强了柳树对柳蓝叶甲的抗性

2024年9月9日，中国农业科学院农业基因组研究所张江、王海涛、湖北大学张凤娟等团队在Microbiome在线联合发表了题为 “Enrichment of novel entomopathogenic Pseudomonas species enhances willow resistance to leaf beetles” 的研究文章。揭示了自然生态系统中昆虫、植物和植物相关微生物群之间复杂的相互作用。为利用合成微生物菌群控制害虫提供了理论基础。

Article，2024-09-09，Microbiome，[IF 13.8]

DOI：https://doi.org/10.1186/s40168-024-01884-z

原文链接：

https://microbiomejournal.biomedcentral.com/articles/10.1186/s40168-024-01884-z

第一作者：Haitao Wang（王海涛）；Fengjuan Zhang（张凤娟）

通讯作者：Jiang Zhang（张江）

主要单位：

中国农业科学院农业基因组研究所（Shenzhen Branch, Guangdong Laboratory of Lingnan Modern Agriculture, Key Laboratory of Synthetic Biology, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Agricultural Genomics Institute at Shenzhen, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Shenzhen 518000, China）

湖北大学（State Key Laboratory of Biocatalysis and Enzyme Engineering, Hubei Hongshan Laboratory, School of Life Sciences, Hubei University, Wuhan 430062, China）

- 摘要 -

植物已经进化出多种防御植食性昆虫的机制，包括形成物理屏障、合成有毒代谢物和激活植物激素反应等。其中植物相关微生物影响植物的生长发育已经被广泛研究，但它们是否在自然生态系统中发挥帮助植物抵御害虫的作用尚不清楚。本研究表明，被柳蓝叶甲危害的柳树（Salix babylonica）叶片比健康柳树叶片更能抵御柳蓝叶甲侵害。人工合成菌群接种实验表明，来自被柳蓝叶甲危害的柳树的植物相关微生物群参与了被柳蓝叶甲危害的柳树对柳蓝叶甲的抗性。微生物组的组成和丰度分析表明，相对于未被柳蓝叶甲危害的柳树，假单胞菌在柳蓝叶甲危害的柳树叶际、根和根际土壤中显著富集。从柳树和根际土壤中分离出49株假单胞菌，鉴定出7株对柳蓝叶甲有毒性的假单胞菌。而且用这7株假单胞菌菌株重新构建了一个合成群落（SynCom-^mix7）进行了接种试验，发现SynCom-^mix7可以显著增强柳树对柳蓝叶甲的抗性。柳树利用特定的昆虫病原细菌来增强对柳蓝叶甲的防御，表明自然生态系统中的植物、昆虫和植物相关微生物群之间存在复杂的相互作用。

- 引言 -

植物在生命周期中面临着各种生物和非生物胁迫。其中生物胁迫植食性昆虫的取食是一种普遍存在的威胁，每年造成的损失约占全球作物总产量的20%。植物已经进化出多种防御策略，帮助它们抵御昆虫的攻击，包括建立物理屏障、产生有毒代谢物和激活植物激素反应等。

其中植物相关微生物影响植物的生长发育已经被广泛研究，但它们是否在自然生态系统中发挥帮助植物抵御害虫的作用尚不清楚。因此，研究植物微生物在植物防御害虫中的作用具有重要意义。

为了解决这一问题，我们以柳树-柳树微生物-柳蓝叶甲三者为研究对象，探究天然微生物菌群在柳树抵御柳蓝叶甲危害过程中发挥的作用和机制。我们将从叶片中分离的菌群回接到正常叶片进行喂食幼虫生测，来确定叶片菌群的作用。对柳树叶际、根和根际土壤分离的菌群进行16S扩增子测序，分析样品中细菌的分类和丰度。从柳树和根际土壤中分离出49株假单胞菌，鉴定出7株对柳蓝叶甲有毒性的假单胞菌。用这7株假单胞菌菌株重新构建了一个合成群落（SynCom-^mix7）进行了接种试验进行验证。

- 结果 -

植物相关菌群在植物防御柳蓝叶甲中的作用

Contribution of plant-associated microbiota in plant defense against P. versicolora

为了研究植物在被植食性昆虫取食时是否会调动植物相关微生物来防御昆虫，我们在武汉的沙湖、南湖两个试验点采集了病树的病叶（SL）、健康树的健康叶（HL-HW）和病树的健康叶（HL-SW），分别喂食给柳蓝叶甲幼虫。从幼虫取食的叶面积来看，与HL-HW或HL-SW相比，柳蓝叶甲幼虫对SL造成的伤害更小（图1A和B）。此外，与HL相比，SL从第3天开始显著抑制了幼虫的生长（图1E），并显著延迟了幼虫的化蛹率（图1C）和羽化率（图1D）。这些结果表明，柳蓝叶甲的取食可以激活植物相关防御，来减轻昆虫的进一步伤害。

为了评估植物相关微生物群落在被柳蓝叶甲危害的柳树叶片对柳蓝叶甲抗性的作用，我们分别从病叶（SynCom-^SL）和健康叶（SynCom-^HL）中分离出了两个微生物群落，并将合成群落重新接种到离体无菌的病叶或健康片中并喂食给柳蓝叶甲幼虫。实验结果表明，与重新接种SynCom-^HL的离体无菌健康叶或病叶相比，重新接种的SynCom-^SL显著降低了柳蓝叶甲幼虫对柳叶的危害（图2A-B），并显著推迟了柳蓝叶甲幼虫的化蛹率（图2C）和羽化率（图2D），显著降低了幼虫的体重（图2E）。结果表明被柳蓝叶甲危害过柳树的植物相关微生物群落参与了对柳树对柳蓝叶甲的防御。

图1 柳蓝叶甲幼虫喂食健康叶和病叶生测实验。

（A）生测第3天柳蓝叶甲幼虫取食叶片表型图。（B）生测第3天柳蓝叶甲幼虫取食叶片面积。（C）柳蓝叶甲幼虫化蛹率。（D）柳蓝叶甲幼虫羽化率。（E）柳蓝叶甲幼虫体重。

图2 SynCom-^SL和SynCom-^HL接种到离体无菌叶片进行柳蓝叶甲的喂食生测。

（A）生测第三天柳蓝叶甲幼虫取食叶片表型图；（B）生测第三天柳蓝叶甲幼虫取食叶片面积；（C）柳蓝叶甲幼虫化蛹率；（D）柳蓝叶甲幼虫羽化率；（E）柳蓝叶甲幼虫体重。

假单胞菌在被柳蓝叶甲危害的柳树中富集

Pseudomonas spp. is enriched in the phyllosphere, root and rhizosphere soil samples of beetle-damaged willows

为了了解不同状态下柳树（健康树和病树）微生物的种类和丰度，我们将采集的样品（叶片、根部和根际土壤）进行16S扩增子测序（图3A）。测序结果基于Bray-Curtis的非度量多维排列（NMDS）分析表明，沙湖和南湖样品中病树和健康树的细菌群落存在显著差异（图3B，ANOSIM，P < 0.01）。根据香农指数和辛普森指数估算α多样性，发现沙湖病树和健康树的细菌α多样性指数存在显著差异（图3C-D，P < 0.01）。

我们用LEfSe分析柳树中细菌丰度差异，其结果表明病树的叶际，根部和根际土壤中假单胞菌属显著高于健康树样品（图4A），同时用假单胞菌选择培养基分离样品中的假单胞菌并计数，结果和LEfSe分析保持一致。以上结果表明，被柳蓝叶甲危害的柳树和健康柳树在细菌种类和丰度上差异显著，而且被柳蓝叶甲危害的柳树样品中假单胞菌属显著高于健康柳树样品。

图3 柳树细菌群落的结构和组成。

（A）采样地点，武汉东湖和南湖两个位点；（B）柳树叶际、根部和根际土壤细菌群落的NMDS。（C）健康柳树与病柳树的细菌群落的香农多样性指数；（D）健康柳树与病柳树的细菌群落的辛普森多样性指数。

图4 LEfSe分析柳树中细菌丰度差异和平板计数法统计假单胞菌数量。

（A-B）沙湖和南湖的健康柳树和病柳树叶际细菌差异；（C-D）沙湖和南湖的健康柳树和病柳树根部细菌差异；（E-F）沙湖和南湖的健康柳树和病柳树根际土壤细菌差异；（G）假单胞菌选择培养基筛选培养叶际假单胞菌并计数；（H）假单胞菌选择培养基筛选培养根部假单胞菌并计数；（I）假单胞菌选择培养基筛选培养根际土壤假单胞菌并计数。

病树中富集的假单胞菌具有抵御柳蓝叶甲的作用

The Pseudomonas enriched on beetle-damaged plants show insecticidal activity against beetles

从被柳蓝叶甲危害的柳树和健康柳树的叶际、根部和根际土壤样品中分离鉴定了49株假单胞菌。对这49株菌株进行16S rRNA基因序列测序，我们基于16S rRNA测序结果构建进化树，分析这49株假单胞菌的亲缘关系。我们根据进化树发现病树叶片中有多株耐冷假单胞菌（Pp）菌株（图5）。

之前的实验已经证明了病树叶片对柳蓝叶甲幼虫具有延迟生长发育的作用，为了验证耐冷假单胞菌菌株是否是引起这种现象的原因，我们便设计了以下实验进行验证：我们将各个耐冷假单胞菌的细胞悬浮液分别涂抹到健康叶片上，并喂食给柳蓝叶甲。我们对幼虫存活率进行记录，以病土中分离的具有杀虫活性的绿针假单胞菌PcS1-2和病根中分离的绿针假单胞菌PcR3-3为阳性对照。由实验结果可知，在9株耐冷单胞菌菌株中，7株菌株对柳蓝叶甲幼虫具有高致死率（图6）。以上的结果表明，在被柳蓝叶甲危害的柳树中富集的一些假单胞菌菌株对柳蓝叶甲幼虫具有杀虫活性。

为了研究假单胞菌菌株在被柳蓝叶甲危害的柳树体内的富集对柳蓝叶甲抗性的贡献，我们重建了由7株从病树叶中分离的耐冷假单胞菌（Pp）菌株组成的合成微生物群落(SynCom-^mix7)。将SynCom-^mix7和假单胞菌菌株PSE37/38分别重新接种到健康柳树叶片上，PBS溶液作为对照，结果可知合成微生物群落对柳蓝叶甲幼虫同样具有高致死率（图7）。

图5 健康柳树与病柳树分离的假单胞菌的系统发育进化树。

从内圈到外圈:（1）假单胞菌属的物种水平分类；（2）在叶际、根部和根际土壤中检测到的假单胞菌；（3）假单胞菌在被甲虫取食的柳树和健康柳树中的分布。

图6 病柳树叶片中富集的假单胞菌杀虫活性生测。

（A）柳蓝叶甲幼虫生存曲线图；（B）生测第3天柳蓝叶甲幼虫取食叶片面积；（C）生测第3天柳蓝叶甲幼虫取食叶片表型图。

图7 合成菌群(SynCom-^mix7)喂食柳蓝叶甲幼虫生存曲线。

- 结论 -

本研究揭示了自然生态系统中植食性昆虫、植物和植物相关微生物群之间复杂的相互作用，为利用合成微生物菌群控制害虫提供了理论基础。本研究以柳蓝叶甲、柳树及其相关微生物为研究模型，研究三者之间相互作用关系，实验结果表明植物在受到植食性昆虫柳蓝叶甲的取食伤害后，会利用植物微生物假单胞菌来延迟柳蓝叶甲的生长发育从而达到保护植物的目的（图8）。

图8 受害柳树通过募集假单胞菌协助抵御柳蓝叶甲的进一步危害。

参考文献

Wang, H., Zhang, F., Zhang, Y. et al. Enrichment of novel entomopathogenic Pseudomonas species enhances willow resistance to leaf beetles. Microbiome12, 169 (2024). https://doi.org/10.1186/s40168-024-01884-z

- 作者简介 -

第一作者

中国农业科学院

农业基因组研究所

王海涛

科研助理

王海涛，中国农业科学院农业基因组研究所科研助理，2023年6月硕士毕业于湖北大学。

湖北大学

生命科学学院

张凤娟

副教授，研究生导师

张凤娟，本硕博毕业于华中农业大学生科院，现就职于湖北大学生命科学学院，副教授，研究生导师，主要研究领域为植物保护，农业微生态。先后主持国家自然科学基金青年和面上项目，湖北省自然科学基金面上基金。以第一或通讯作者身份在Molecular Plant，Microbiome，PLoS Pathogens，Plant Biotechnology Journal，Plant Disease，Pest Management Science等杂志上发表高水平论文20余篇。

通讯作者

中国农业科学院

农业基因组研究所

张江

研究员，博士生导师

张江，中国农业科学院农业基因组研究所研究员，博士生导师，国家级人才项目入选者。长期从事植物保护与抗虫生物技术研究。先后主持国家自然科学基金，国家重点研发计划课题、德国马普伙伴小组等项目。以第一或通讯作者身份在Science，Molecular Plant，PNAS，Microbiome，Plant Biotechnology Journal，Journal of Integrative Plant Biology，Plant Cell & Environment，Plant Journal，Pest Management Science等杂志上发表高水平论文50余篇，授权发明专利10项。

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