大家好，今天我们来了解一项关于水凝胶支架的技术——4D生化光定制——《4D Biochemical Photocustomization of Hydrogel Scaffolds for Biomimetic Tissue Engineering》发表于《Accounts of Materials Research》。随着科技的发展，人们对组织工程和生物材料的要求越来越高。水凝胶支架作为一种重要的生物材料，其4D生化光定制技术为模拟体内细胞外基质与细胞的相互作用提供了新途径。通过光化学调控，我们能够精确定制水凝胶的生物化学性质，从而更好地引导细胞命运，这在组织工程和再生医学等领域具有广阔的应用前景。

*本文只作阅读笔记分享*

一、引言

多细胞生命与组织复杂性：多细胞生命源于活组织展示的异质性复杂性，包括三维空间和时间（4D）。每个细胞接收和解释无数独特的物理化学线索，这对试图模仿活组织的工程师来说是一个挑战。

传统生物材料的局限性：虽然传统生物材料允许体物理可调性和体外可溶性因子的呈现，但在开发定制网络生物化学、细胞-细胞和细胞-细胞外基质（ECM）相互作用的强大方法方面，人们的兴趣日益浓厚。

光刻技术的优势：光刻处理水凝胶为时空指定复杂细胞命运提供了一种手段，包括在纳米和微观尺度上的迁移、入侵、（转）分化和多细胞组装。光作为用户指导材料修改的独特强大刺激，因为它在负载细胞的凝胶的用户指定子体积内提供近乎瞬时和空间分辨的调制。这些参数对现代组织培养至关重要：支架修改必须比其寻求影响的细胞过程快得多（≪103 s），并且具有亚细胞分辨率（≪101 μm）。

二、光化学水凝胶定制的方法

2.1 功能化凝胶支架的本体光聚合

早期应用：最早的水凝胶光图案化努力是将生物活性肽和药物选择性地封装到基本的凝胶体积中。例如，通过对聚（乙二醇）（PEG）二（甲基）丙烯酸酯、明胶甲基丙烯酰胺（GelMA）、甲基丙烯酸化透明质酸（MeHA）等进行化学修饰，实现了水解介导的药物递送、图案化光制造和生物分子呈现。

细胞封装的改进：为了简化细胞封装，将丙烯酰胺修饰的细胞粘附肽作为侧链或双功能化交联剂连接到丙烯酸酯凝胶中。此外，引入酶可降解的肽骨架解决了早期与3D细胞形态和活性相关的限制，产生了更仿生和机械动态的合成ECM。

2.2 水凝胶的光刻定制

光学光刻技术：光学光刻作为生物材料制造的工具早于3D细胞封装。表面通常经过功能化处理并使用光进行图案化。应用于生化凝胶图案化，这些技术可在材料中产生具有x-y可调性的活化柱状体积。例如，通过不透明移动光掩模、预定义光掩模、不同激光功率和动态可调数字微镜等方式实现复杂梯度形成。

图案形成的控制：图案在x-y空间更容易操纵，可通过多种方式实现复杂梯度形成。而在z维度，图案的深度和完整性取决于光的散射和衰减。自然衰减是在单光子光刻中产生可变z激活的唯一方法，但受到限制。聚焦激光和高阶吸收现象可实现全三维控制。

图像引导的图案制作：图像引导的图案制作能够通过各种输入灵活定制材料，例如通过高保真地再现原生微血管结构，还可以编码非二进制图像，实现高分辨率非二进制定。

三、凝胶生物化学的4D定制

3.1 凝胶内生化信号的光固定

早期研究：例如，Luo和Shoichet通过在超低熔点琼脂糖上修饰羟基，用邻硝基苄基（oNB）光笼半胱氨酸探针选择性结合可溶性肽侧链，成功引导了背根神经节的生长。

解决光介导的矛盾：为了解决光介导的凝胶化和图案化之间的矛盾，采取了一些措施，如使用红移光聚合和生物正交点击化学。例如，流行的丙烯化水凝胶（如GelMA）可以预加载近紫外光可降解的侧链基团，同时使用可见光进行凝胶化；生物正交点击化学如 SPAAC和肟连接的应用，取代了利用凝胶基质中不确定缺陷作为侧链连接位点的方法。

酶辅助修饰：光介导的水凝胶修饰也可以借助酶来进行，如通过光笼激活的转谷氨酰胺酶因子XIII（FXIIIa）底物来选择性捕获Q肽标记的生物分子，从而实现对位点特异性修饰的整个生长因子的图案化。

精确固定生物素化蛋白质：最近的研究展示了使用高度多光子敏感的香豆素光笼和多阶段的生化及酶适应来精确固定生物素化蛋白质的能力，并对轴突引导进行了令人印象深刻的控制。

3.2 凝胶内生化线索的光去除

从2D应用到3D：光降解链接器最初从2D光图案应用中改编而来，用于按需药物递送和细胞粘附肽从水凝胶中的释放。例如，通过光降解控制药物递送、水凝胶机械性能和细胞释放。

多重和逻辑释放：这些链接器可以通过使用波长或刺激正交化学实现多重和逻辑释放。例如，硝基苄基衍生的链接器在不同波长下优先切割以用于药物递送，并且可以通过引入正交可降解部分来实现布尔逻辑响应。

使用复杂生物分子：除了合成小分子和肽核心外，还可以使用更复杂的可裂解生物分子如核苷酸和重组蛋白来组装光降解链接器。例如，使用合成修饰的PhoCl构建重组光降解链接器，实现了从水凝胶中选择性释放tethered PhoCl-表皮生长因子（EGF）嵌合体蛋白，以控制HeLa细胞的球体形成。

3.3 凝胶内生化线索的可逆光固定

可逆水凝胶修饰的方法：最近的努力试图建立允许可逆水凝胶修饰的方法，例如通过利用反应和 / 或波长正交性将光固定和随后的光释放结合到一个平台中。例如，DeForest和 Anseth之前展示了可见光介导的硫醇-烯反应与近紫外介导的oNB裂解相结合，实现了合成肽与PEG基凝胶的可逆连接。

多周期固定的方法：一些方法实现了多周期图案化生物分子的固定，但存在一些限制。例如，Anseth实验室设计的烯丙基硫醚连接剂用于硫醇-烯光连接，理论上可以循环使用，但实际上受到非特异性自由基反应和反应性烯丙基硫醚数量统计减少的限制。

光图案化的非共价相互作用：光图案化的非共价相互作用为实现真正的循环材料图案化提供了最清晰的途径。例如，West实验室发现的LOVTRAP蛋白对，包括来自燕麦的蓝光敏感LOV2域和工程改造的affibody Zdark1，在无光时强烈结合，光照时可逆分离，为工程光可逆生物材料提供了有力工具。

3.4 光图案化生物分子的激活/生成

避免扩散引入/去除的复杂性：许多生物分子在低浓度下以可溶性和束缚形式具有活性，为了避免在3D细胞培养中扩散引入/去除的复杂性，一种新兴策略是在光暴露之前将无活性的 “光笼” 生物分子束缚在整个凝胶体积中。例如，使用光笼血管内皮生长因子（VEGF）肽模拟物和环状 RGD 来选择性促进细胞群体中的血管生成。

“释放-激活”和“束缚-激活”策略：生物分子信号的激活可以通过光图案化的上下文呈现变化来实现，包括“释放-激活”和“束缚-激活”策略。例如，Shoichet实验室展示了通过光图案化EGF的释放来触发局部内吞作用和经典EGF介导的信号传导；而使用Delta - like protein 1实现了“束缚-激活”策略，用于Notch信号传导。

原位功能组装：另一种潜在的强大方法是通过原位功能组装实现图案化蛋白质激活，例如 “光激活 SpyLigation”（LASL）能够通过特定和分子定义的化学实现图案化基因组编辑和4D生物材料定制。例如，通过将光笼SpyCatcher和SpyTag融合到非功能性分裂片段对中，展示了在溶液、生物材料和活哺乳动物细胞中稳定重组生物活性蛋白质的能力。

混合 “生物材料”：del Campo实验室构建了由合成基质和共固定细胞组成的混合“生物材料”，用于光调节生产活性信号分子。例如，使用工程细菌与活哺乳动物细胞共培养，展示了蛋白质的生产和直接通信，为实现生物生产的4D完全控制展示了潜力。

四、总结与展望

领域的进展：光介导的水凝胶支架的生物化学（去）修饰和图案化蛋白质激活 / 生成在时空引导细胞命运方面是非常宝贵的工具。许多历史挑战已得到解决，包括模式正交性、规模和生物化学修饰等方面。

材料的发展：从早期的合成修饰肽或小分子药物到现在使用残基特异性修饰的完整蛋白质和完全重组的光不稳定系统，大分子构建模块也取得了进展。

硬件的进步：多光子光刻等硬件的改进预示着未来分辨率和体积图案化速率将显著提高，这将对该领域产生深远影响。

未来的方向：该领域需要开始实施水凝胶光学光刻以获得新的生物学见解，进一步推动在基础生物学研究、下一代治疗开发和基于类器官的疾病建模等方面的努力。

参考文献：

       Francis RM, DeForest CA. 4D Biochemical Photocustomization of Hydrogel Scaffolds for Biomimetic Tissue Engineering. Acc Mater Res. 2023 Aug 25;4(8):704-715.