1. 全基因组扩增(whole-genome amplification, WGA)
单细胞扩增能将pg级或fg级的单细胞DNA扩增为可满足测序要求的ug级DNA量,从而使单细胞测序变为可能。目前存在的主要三种扩增方法有:简并寡核苷酸引物PCR扩增(DOP-PCR)、多重置换扩增(MDA)、多次退火环状循环扩增(MALBAC),三种方法各有优缺点。
WGA三种方法比较
扩增效果:
MDA相比于MALBAC有更高的覆盖度,从而可以检测更多的单核苷酸变异(SNVs);但是MALBAC和DOP-PCR相比于MDA,覆盖的均一度更好,从而对检测大于1Mb的拷贝数变异(CNVs)的灵敏度和特异性更强。
2. 简并寡核苷酸引物PCR扩增(DOP-PCR)
基于PCR的全基因组扩增。用随机引物进行指数扩增,对不同的扩增序列会有较大影响。
3. 多重置换扩增(MDA)
利用随机六碱基引物在多个位点与模板DNA退火,并在高扩展效率和保真性的DNA聚合酶作用下,在DNA的多个位点同时开始复制,沿着模板链合成DNA,同时取代模板的DNA互补链,被取代的模板链又会作为新的模板链进行下一次扩增,从而最终获得大量的DNA。
多重置换扩增利用了随机引物和链置换的ϕ29聚合酶(一种具有较高连续合成能力以及链置换的DNA聚合酶,具有3’-5’外切酶活性, 可保证扩增的高保真性。)在恒温条件下的扩增,相比于PCR扩展能降低序列GC含量造成的扩增偏好,并对扩增的覆盖度大幅提升。但是MDA是非线性的扩增,依然存在较大的扩增偏好性。
4. 多次退火环状循环扩增(Multiple annealing and looping-based amplification cycle, MALBAC)
MALBAC为置换预扩增和PCR扩增的组合,通过拟线性的预扩增来降低非线性扩增的偏好性,在PCR扩增过程中使用MALBAC引物27个共有序列相同的寡聚核苷酸作为引物,只有以半扩增产物为模板才能产生两端互补的完整扩增产物,完成预扩增。
MALBAC扩展步骤如下:
(1)单细胞双链DNA在94℃变性成单链,随后在0℃时随机引物均匀的结合到单链DNA模板上;
(2)65℃时链置换DNA聚合酶用来生成不同长度序列(0.5kb-1.5kb)的半扩增产物(semi-amplicon),随后在94℃变性成单链从模版上脱离;
(3)在随后的5个温度的循环中,对半扩增产物进行进一步的扩增来产生完整扩增产物(full-amplicons),且完整扩增产物的5’端和3’端互补;
(4)温度降到58℃进行完整扩增产物的环化,同时并防止进一步扩增和序列的杂交;
(5)半扩增产物和基因组DNA则继续循环来生成完整扩增产物;
(6)环化的完整扩增产物即完成拟线性的预扩增过程,随后进行PCR的指数扩增。