单细胞测序全基因组扩增（WGA）方法

news2024/11/6 3:14:07

1. 全基因组扩增（whole-genome amplification， WGA）

单细胞扩增能将pg级或fg级的单细胞DNA扩增为可满足测序要求的ug级DNA量，从而使单细胞测序变为可能。目前存在的主要三种扩增方法有：简并寡核苷酸引物PCR扩增（DOP-PCR）、多重置换扩增（MDA）、多次退火环状循环扩增（MALBAC），三种方法各有优缺点。

WGA三种方法比较

扩增效果：

MDA相比于MALBAC有更高的覆盖度，从而可以检测更多的单核苷酸变异（SNVs）；但是MALBAC和DOP-PCR相比于MDA，覆盖的均一度更好，从而对检测大于1Mb的拷贝数变异（CNVs）的灵敏度和特异性更强。

2. 简并寡核苷酸引物PCR扩增（DOP-PCR）

基于PCR的全基因组扩增。用随机引物进行指数扩增，对不同的扩增序列会有较大影响。

3. 多重置换扩增（MDA）

利用随机六碱基引物在多个位点与模板DNA退火，并在高扩展效率和保真性的DNA聚合酶作用下，在DNA的多个位点同时开始复制，沿着模板链合成DNA，同时取代模板的DNA互补链，被取代的模板链又会作为新的模板链进行下一次扩增，从而最终获得大量的DNA。

多重置换扩增利用了随机引物和链置换的ϕ29聚合酶（一种具有较高连续合成能力以及链置换的DNA聚合酶，具有3’-5’外切酶活性，可保证扩增的高保真性。）在恒温条件下的扩增，相比于PCR扩展能降低序列GC含量造成的扩增偏好，并对扩增的覆盖度大幅提升。但是MDA是非线性的扩增，依然存在较大的扩增偏好性。

4. 多次退火环状循环扩增（Multiple annealing and looping-based amplification cycle， MALBAC）

MALBAC为置换预扩增和PCR扩增的组合，通过拟线性的预扩增来降低非线性扩增的偏好性，在PCR扩增过程中使用MALBAC引物27个共有序列相同的寡聚核苷酸作为引物，只有以半扩增产物为模板才能产生两端互补的完整扩增产物，完成预扩增。

MALBAC扩展步骤如下：

（1）单细胞双链DNA在94℃变性成单链，随后在0℃时随机引物均匀的结合到单链DNA模板上；
（2）65℃时链置换DNA聚合酶用来生成不同长度序列（0.5kb-1.5kb）的半扩增产物(semi-amplicon)，随后在94℃变性成单链从模版上脱离；
（3）在随后的5个温度的循环中，对半扩增产物进行进一步的扩增来产生完整扩增产物(full-amplicons)，且完整扩增产物的5’端和3’端互补；
（4）温度降到58℃进行完整扩增产物的环化，同时并防止进一步扩增和序列的杂交；
（5）半扩增产物和基因组DNA则继续循环来生成完整扩增产物；
（6）环化的完整扩增产物即完成拟线性的预扩增过程，随后进行PCR的指数扩增。