第一次微生物学实验

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前言

在学习生物的过程中，熟练掌握各种生物实验方法是必须的，本系列文章，将主要记录做微生物学实验的笔记，便于以后的再度查看。
本章主要讲述两个实验：

1. 显微镜油镜的使用以及细菌的简单染色法
2. 细菌的革兰氏染色以及芽孢染色法

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一、显微镜油镜的使用以及细菌的简单染色法

1.1. 实验目的

1.学习并掌握普通光学显微镜油镜的使用技术；

2.学习微生物制片、染色的基本技术，掌握细菌的简单染色法及无菌操作技术；

3.观察细菌的基本形态。

1.2. 实验原理

1. 染色原理：

用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类：

碱性染料的离子带正电荷，因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。

酸性染料的离子带负电荷，当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。

中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。

2. 简单染色法：

是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的染色法，简单染色只能观察细菌外形及排列方式，但不能辨别细菌细胞的构造。

显微镜油镜工作原理：

利用油镜不但能增加照明度，更主要是能增加数值口径，因为显微镜的放大效能是由其数值口径决定的

显微镜的分辨率是指显微镜能够辨别两点之间最小距离的能力（它与接物镜的数值口径成正比）

1.3. 实验材料

1. 活材料：
   金黄色葡萄球菌
   蜡状芽孢杆菌
2. 染色液和试剂：
   复红、美兰、乙醚乙醇、香柏油。
3. 器材：
   载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜。

1.4.实验步骤

1. 涂片： 按无菌操作法取菌涂片（即先用酒精灯对接种杯消毒，然后将菌接种到载玻片上的蒸馏水中）

2. 干燥与固定： 让涂片在酒精灯火焰上烘干（！！注意，不要把菌烘焦了，拿高点）

3. 染色： 将固定过的涂片加复红或美兰染色1-2 min

4. 水洗：用水洗去涂片上的染色液

5. 干燥：将洗过的涂片用吸水纸吸干

6. 镜检： 先低后高，找出适当的视野后，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。（直接先将载物台调大最高，然后慢慢调准焦螺旋向下，找到细菌）

7. 绘图

8. 实验完毕后处理:

8.1. 将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净：
先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。再用擦镜纸沾少许乙醚乙醇擦镜头。 再用干净的擦镜纸将镜头擦。

8.2. 看后的染色玻片先用废纸将香柏油擦干净，再用乙醚-乙醇擦拭后放入锅内清洗

1.5. 实验结果及讨论

1.5.1 实验结果

1. 金黄色葡萄球菌

2. 枯草芽孢杆菌：

1.5.2. 讨论

1、油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应注意些什么？

解：
使用油镜时要滴一滴香柏油覆盖玻片样本，然后用物镜观察；在使用普通物镜时，不需要涂抹油或其他介质，直接将物镜放置在待观察的样本上即可。
油镜需要与样本接触，使用油镜时，需要小心操作，以避免将油镜与样本之间产生气泡或划伤物镜表面，并且油镜要进行清洁和保养。

2、按比例绘出你所观察到的细菌的形态，并显示两菌的排列方式

无

二、细菌的革兰氏染色以及芽孢染色法

2.1. 实验目的

1. 学习并掌握革兰氏染色法和芽孢染色法

2. 巩固显微镜油镜的使用技术

2.2. 实验原理

2.2.1. 革兰氏染色原理

该染色法将细菌分为G+菌（革兰氏阳细菌）和G-菌（革兰氏阴细菌）。是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的

1. G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经
   脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，
   因此细菌仍保留初染时的颜色

2. G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽
   聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类
   脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复
   合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成
   红色

2.2.2. 芽孢染色法原理

芽孢是一种由某些细菌形成的耐热、耐干燥的休眠体，具有很高的抵抗力。细菌能否形成芽孢以及芽孢的形状、芽孢在芽胞囊内的位置、芽孢是否膨大等特征是鉴定细菌的依据之一。

芽孢染色法的基本原理是:

用着色力强的染色剂孔雀绿或石炭酸复红,在加热条件下染色，使染料不仅进人菌体也可进人芽抱内,进人菌体的染料经水洗后被脱色,而芽抱一经着色难以被水洗脱,
当用对比度大的复染剂染色后 ,芽抱仍保留初染剂的颜色,而菌体和芽抱囊被染成复染剂的颜色，使芽抱和菌体更易于区分。

2.3. 实验材料

2.4.实验步骤

2.4.1. 革兰氏染色：

1. 涂片
2. 干燥与固定
3. 初染：加适量结晶紫染色液染色1-2 min
4. 水洗
5. 媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染1 min
6. 水洗：用水洗去碘液
7. 脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色20-25 s至
   流出液无色，立即水洗。
8. 复染：滴加蕃红复染2 min
9. 水洗
10. 干燥
11. 镜检：先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。

2.4.1. 芽孢染色：

使用改良的Schaeffer-Fulton氏染色法
芽孢呈绿色，芽孢囊及菌体为红色

1. 制备菌悬液：加1~ 2滴水于小试管中，用接种环挑取2~3环菌
   苔于试管中，搅拌均匀，制成浓的菌悬液。

2. 染色：加孔雀绿染液2~3滴于小试管中，并使其与菌液混合均
   匀，然后将试管置于沸水浴的烧杯中，加热染色15~20 min。

3. 涂片固定：用接种环挑取试管底部菌液数环于洁净载玻片上，

4. 涂成薄膜，然后将涂片通过火焰3次温热固定。

5. 脱色：水洗，直至流出的水无绿色为止。

6. 复染：用番红染液染色2~3 min，倾去染液并用滤纸吸干残液
   （不水洗）

7. 镜检：干燥后用油镜观察

8. 实验后妥善处理实验用品

2.5. 实验结果及讨论

革兰氏染色——金黄色葡萄球菌

革兰氏染色——大肠杆菌

这张拍的真模糊，看不出是杆状的（应该是样品的问题）

芽孢染色——枯草芽孢杆菌

1.绘出金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的形态图，并注明两菌的革兰氏染色反应性。

金黄色葡萄球菌：一个圆形的球状细菌，通常成群聚集，呈葡萄状。革兰氏染色反应性为阳性。
大肠杆菌：一个细长的杆状细菌，通常呈链状排列。革兰氏染色反应性为阴性

2.当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠？

使用已知的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌作为阳性和阴性对照，确保染色剂和染色时间的正确使用，观察染色后的细菌颜色和形态是否与已知的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌相符。

3.绘图说明你所观察的枯草芽孢杆菌菌体形态，芽孢的形态及着生位置。它们各呈什么颜色。
枯草芽孢杆菌：一个细长的杆状细菌，通常呈链状排列。芽孢的形态为椭圆形，着生在细菌的中央或稍偏一侧。使用芽孢染色后观察枯草芽孢杆菌，菌体颜色通常为浅红色，芽孢颜色通常为绿色。

4.若涂片中观察到的只是大量游离芽孢，很少看到芽孢囊和营养细胞，你认为这是什么原因？

染色技术问题：染色过程中可能出现了某些问题，如染色剂的浓度不足或染色时间过短，导致芽孢囊未被充分染色。

观察时间问题：可能需要更长的观察时间才能观察到芽孢囊的形成。

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总结

主要学习了细菌的集中染色方法，通过显微油镜观察等。。。。

林花谢了春红，太匆匆，无奈朝来寒雨晚来风。胭脂泪…

–2023-10-6 生物技术篇