越来越多的证据表明，肿瘤免疫微环境的变化与肿瘤的存活和进展有关（Soysal等人，2015年；Hinshaw和Shevde，2019年）。然而，氧化应激及其与肝癌免疫微环境的关联机制仍不清楚。本研究旨在筛选与免疫相关的氧化应激相关基因（OSRGs），并建立氧化应激相关特征来预测肝癌预后。这项研究为肝癌治疗的免疫生物标志物和治疗策略提供了见解。
1.正常样本和肿瘤样本之间的免疫微环境
正常组和肿瘤组共获得 9 个 DIC（图 1A），肿瘤组的免疫和基质评分最低，肿瘤纯度评分最高（图 1B-D）。
图1 正常样本与肿瘤样本的免疫微环境
2.确定三种免疫亚型
根据 9 个 DICs，进行了无监督分层聚类分析，最佳肿瘤亚型为 K = 3（图 2A）。结果得出了三个亚型，即聚类 1、2 和 3，分别有 146、154 和 65 个肝癌样本（图 2B）。模糊聚类比例（PAC）分析进一步验证了最佳肿瘤亚型为 K = 3（图 2C）。生存分析表明，在所有聚类中，聚类 1 的预后最好（图 2D）。预后亚型与临床信息的相关性见图 2E-G。
图2 无监督分层聚类分析
3. 与免疫有关的 OSRGs
根据 758 个 OSRG，确定矩阵变换的软阈值功率为 6，其中 log2k 和 log2p k) 之间相关系数的平方为 0.85（图 3A、B）。筛选出六个模块，并计算了临床特征与每个模块之间的相关性。与临床特征相关性最高的棕色和绿色模块被选为关键模块，分别有 80 个和 58 个免疫相关 OSRG（图 3C、D）。
图3 加权基因共表达网络分析结果
4. OSRG 评分预后模型
在 138 个免疫相关 OSRG 的基础上，经过单变量 Cox 回归分析得出 29 个预后相关 OSRG（图 4A）。对这 29 个预后相关的 OSRG 进行 LASSO 回归分析，得出 18 个 OSRG（图 4B、C）。逐步Cox回归分析得出了7个OSRGs：BDNF、FASLG、KLF2、MMP9、S100A9、SGCB和TNFRSF1B，并将其用于建立OSRG评分预后模型（图4D）。与低OSRG评分组相比，高OSRG评分组患者的预后较差（P＜0.05；图5A,B）。图 5C 和 D 分别显示了 TCGA 和 GSE14520 数据集中 OSRG 评分和生存状况的分布。TCGA 数据集中 1 年、3 年和 5 年的 OS 曲线下面积（AUC）分别为 0.753、0.791 和 0.737，GSE14520 数据集中分别为 0.711、0.700 和 0.673（图 5E、F）。此外，还评估了OSRG高分和低分与临床信息（年龄、性别、分级、病理T/N/M和分期）的相关性，结果显示OSRG得分与群集、分级、病理T和分期显著相关（图5G）
图4 氧化应激相关基因（OSRG）评分预后特征
图5 OSRG 评分预后特征的生成、评估和验证
5.OSRG 高分组和低分组之间的免疫微环境
根据TCGA样本的表达谱数据，使用MCPcounter算法评估免疫细胞浸润得分，结果显示高OSRG得分组和低OSRG得分组之间有6个DIC（图6A）。16个免疫基因组的富集得分在高OSRG得分组和低OSRG得分组之间存在显著差异（图6B）。
图6
6. GSEA
对高OSRG评分组和低OSRG评分组的HALLMARK基因集的差异进行了GSEA比较，截断值为p< 0.05 and NES >1。结果显示，8 个 HALLMARK 基因的富集途径在两组间存在显著差异（图 6C），包括脂肪酸代谢、糖酵解和胆汁酸代谢。
7. 构建预测患者 OS 的诺莫图
为了探索临床病理特征与预后模型之间的关系，对TCGA样本中的年龄、性别、病理MNT、分期、分级和OSRG评分进行了分析，结果显示病理T和OSRG评分是独立的预后因素（P＜0.05；图7A、B），病理T和OSRG评分的C指数分别为0.600和0.687。此外，还利用病理 T 和 OSRG 评分建立了诺莫图（图 7C），并通过测量 C 指数、校准曲线和 ROC 曲线验证了其性能。结果显示，诺莫图的 C 指数为 0.703，校准图显示诺莫图准确估计了死亡率（图 7D）。生存分析表明，诺莫图与患者的预后显著相关（图 7E）。ROC 曲线显示，1 年、3 年和 5 年的 AUC 分别为 0.725、0.751 和 0.720（图 7F）。这些结果表明诺莫图具有相当高的可靠性。
图7 构建提名图
总结
总之，作者构建了一个可靠的 OSRG 相关预后特征，它与免疫系统密切相关，可以准确预测生存期，并为肝癌患者提供了预测生物标志物或潜在靶点的见解。
