使用宏基因组的方法快速鉴定新冠病毒SARS-CoV2

一、如果不考虑成本，可以使用宏基因组测序的方法来快速鉴定新冠病毒SARS-CoV2，这种方法无需扩增、分析简单、准确度高。原理是直接将测序得到的序列数据与分类物种数据库比对，从而得到鉴定结果。本文使用centrifuge工具来进行物种（病毒）分类鉴定

二、 流程概览图如下，是不是很简单？

环境搭建: 为了快速完成环境搭建，节省95%以上时间。

本文使用docker + conda (mamba) 作为基础分析环境，镜像获取：docker/docker-compoes 的安装及镜像构建见《基于docker的生信基础环境镜像构建》,docker镜像基于ubuntu21.04构建，并安装有conda/mamba，ssh服务。并尝试初次运行时初始化安装所需软件下载所需文件（作为代价首次运行时间会较长，切需网络通畅），即实现自动初始化的分析流程。

# 拉取docker镜像
docker     pull     doujiangbaozi/sliverworkspace:latest

# 查看docker 镜像
docker     images

基础环境配置，docker-compose.yml 配置文件，可以根据需要自行修改调整

version: "3"
services:
  SarsCov2:
    image: doujiangbaozi/sliverworkspace:latest
    container_name: SarsCov2
    volumes:
      - /media/sliver/Data/data:/opt/data:rw                               #挂载原始数据，放SC2目录下
      - /media/sliver/Manufacture/SC2/envs:/root/mambaforge-pypy3/envs:rw  #挂载envs conda环境目录
      - /media/sliver/Manufacture/SC2/config:/opt/config:rw                #挂载config conda配置文件目录
      - /media/sliver/Manufacture/SC2/ref:/opt/ref:rw                      #挂载reference目录
      - /media/sliver/Manufacture/SC2/result:/opt/result:rw                #挂载中间文件和输出结果目录
    ports:
      - "9024:9024"                                                        #ssh连接端口可以按需修改
    environment:
      - TZ=Asia/Shanghai                                                   #设置时区
      - PS=20191124                                                        #修改默认ssh密码

基础环境运行

# docker-compose.yml 所在目录下运行
docker-compose up -d

# 或者 
docker-compose up -d -f /路径/docker-compose.yaml

# 查看docker是否正常运行,docker-compose.yaml目录下运行
docker-compose ps

# 或者
docker ps

docker 容器使用，类似于登录远程服务器

# 登录docker，使用的是ssh服务，可以本地或者远程部署使用
ssh root@192.168.6.6 -p9024

# 看到如下，显示如下提示即正常登录
(base) root@SliverWorkstation:~# 

三. 分析流程

1. 变量设置：

   #样本编号
   export sn=SRR10971381
   #数据输入目录
   export data=/opt/data
   #数据输出、中间文件目录
   export result=/opt/result
   #conda安装的环境目录
   export envs=/root/mambaforge-pypy3/envs
   #设置可用线程数
   export threads=8
   

2. 数据简单过滤：

   #conda检测环境是否存在，首次运行不存在创建该环境并安装软件
   if [ ! -d "${envs}/qc" ]; then
     mamba env create -f /opt/config/qc.yaml
   fi
   
   conda activate qc
   
   mkdir -p ${result}/${sn}/clean
   mkdir -p ${result}/${sn}/qc
   
   fastqc ${data}/SC2/${sn}_1.fastq.gz ${data}/SC2/${sn}_2.fastq.gz -o ${result}/${sn}/qc
   
   fastp -w ${threads} -i ${data}/SC2/${sn}_1.fastq.gz -I ${data}/SC2/${sn}_2.fastq.gz \
     -o ${result}/${sn}/clean/${sn}_1_clean.fastq.gz -O ${result}/${sn}/clean/${sn}_2_clean.fastq.gz \
     -h ${result}/${sn}/qc/${sn}_fastp.html -j ${result}/${sn}/qc/${sn}_fastp.json 
   
   fastqc ${result}/${sn}/clean/${sn}_1_clean.fastq.gz ${result}/${sn}/clean/${sn}_2_clean.fastq.gz \
     -o ${result}/${sn}/qc
   
   multiqc ${result}/${sn}/qc/ -f -o ${result}/${sn}/qc
   
   conda deactivate
   

3. Centrifuge 对序列进行物种鉴定

   #conda检测环境是否存在，首次运行不存在创建该环境并安装软件
   if [ ! -d "${envs}/centrifuge" ]; then
     mamba env create -f /opt/config/centrifuge.yaml
   fi
   
   conda activate centrifuge
   
   if [ ! -f "/opt/ref/centrifuge-idx/hvc.4.cf" ]; then
   	mkdir  -p /opt/ref/centrifuge-idx
   	aria2c https://zenodo.org/record/3732127/files/h+v+c.tar.gz?download=1 -d /opt/ref/centrifuge-idx
   	tar -zxvf /opt/ref/centrifuge-idx/h+v+c.tar.gz "/opt/ref/centrifuge-idx"
   fi
   
   centrifuge \
     -x /opt/ref/centrifuge-idx/hvc \
     -1 ${result}/${sn}/clean/${sn}_R1.fastq.gz \
     -2 ${result}/${sn}/clean/${sn}_R2.fastq.gz \
     --report-file ${result}/${sn}/${sn}.clean.report.tsv \
     -S ${result}/${sn}/${sn}.clean.result.tsv \
     -p ${threads}
   
   conda deactivate
   

4. Centrifuge输出结果转换为kraken格式，便于pavian交互式分析

   conda activate centrifuge
   
   centrifuge-kreport \
     -x /opt/ref/centrifuge-idx/hvc \
     ${result}/${sn}/${sn}.clean.result.tsv > ${result}/${sn}/${sn}.kraken2.report.tsv
   
   conda deactivate
   

5. pavian docker运行，配置docker-compose.yaml如下

   version: "3"
   services:
     pavian:
       image: florianbw/pavian:latest
       container_name: pavian
       ports:
         - "5000:80"
   

   运行docker镜像：docker-compose.yaml文件相同目录下运行：

   #运行docker镜像
   docker-compose up -d
   
   #查看docker容器运行情况,docker-compose.yaml相同目录下运行
   docker-compose ps
   
   #或者
   docker ps
   

   pavian容器运行起来之后，打开浏览器，地址栏输入http://localhost:5000,可以看到如下图：
   

6. 点击右侧Browse按钮，上传输出文件SRR10971381.kraken2.report.tsv

7. 点击左侧按钮可以看到图形化分析结果，比对上的16.2%；没比对上的83.8%

   

8. 点击左侧Sample可以看到桑基图如下：Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus 59.5k，结果很明显了。

   

9. 可以点击左侧Generate HTML report导出该报告: Uploaded_sample_set-report.html