回顾

        在建库之前，我们需要对先前提取的核酸进行质检。只有质检合格的样本才能继续建库、测序、分析。（质检的内容在上一章节也有描述）这里再回顾下质检的内容主要分以下几部分：

1.  凝胶电泳实验: DNA是否降解 ，是否有其他的污染(跑胶， 与marker条带比较)

2. 紫外分光光度计测OD值: 检测提取DNA纯度情况（OD260/OD280比值约接近1.8，说明提取DNA纯度越高）

3. Qubit浓度定量。

DNA文库构建

常规基本的步骤有：1 DNA的片段化、2: 末端补平，3 端加A 、4  连接测序接头、5 PCR扩增和纯化。

01 DNA的片段化

        建库的第一步就是获得片段大小合适的DNA分子，那么就需要对DNA 进行打断.

问题：那么问题来了，DNA打断多少bp合适？

        1.取决于测序仪，比如准备上PE150, 那么打断的片段可以在300bp左右，比如上SE50,只要打断50~100bp即可；（这里没有理解的话，要和测序原理联系起来）

        2.取决测序的目的，如果我们测序的reads是用于组装，这样我们可以将打断到250左右，有更多的overlap区域，便于我们数据组装，可变剪切。

片段化的方法主要分酶法打断和超声波打断。

        酶法打断: 用限制性内切酶特异性识别并切割磷酸与脱氧核糖之间的化学键，需要控制酶切时间和酶量。优势：高通量可一次性做多个样本，易操作；劣势：偏好性严重，对样本的质量要求严苛。

        超声波打断:自适应聚焦声波在样本中造成气穴现象从而机械随机的切断DNA，长片段的DNA，受到的剪切力比较大。优势：片段随机打断，无偏好性。劣势：成本高，机械损伤大。

问题：什么情况如何选择酶法打断和超声波打断？

        1.根据样本的情况：比如起始量低（低于50ng以下）  这种情况 不宜用机械打断，机械打断对样本损伤比较大，损失更多样本导致建库失败。更适合用酶切的方法；

        2.实验的目的和需求：比如甲基化测序、Chip-Seq 测序更适合用机械打断。

打断存在的问题：片段化不足与过度

完整内容请点击原文：4. 实验技术—测序数据不好，可能是建库出了问题？(上） https://mp.weixin.qq.com/s/SdPrRA2igTWd7Dhd0U1uWg