TITLE：Comparative transcriptome analysis reveals the resistance regulation mechanism and fungicidal activity of the fungicide phenamacril in Fusarium oxysporum
译名：比较转录组分析揭示了杀菌剂氰烯菌酯对尖孢镰刀菌的抗性调控机制和杀菌活性
期刊：Scientific Reports
日期：2022年6月
下载链接：https://doi.org/10.1038/s41598-022-15188-5

研究介绍：
尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum，Fo）是一种重要的土传病原真菌复合体，可引起农作物血管枯萎病和人类的一些机会性疾病。已广泛报道杀菌剂氰烯菌酯对禾谷镰刀菌和藤黑镰刀菌具有抗真菌活性。在本研究中，发现I型肌球蛋白FoMyo5中的氨基酸取代（V151A 和S418T）导致植物病原Fo分离株对氰烯菌酯的天然低抗性。因此，比较了在1μg/mL氰烯菌酯处理后两种对氰烯菌酯耐药的Fo分离株FoII5、Fo1st和一种对氰烯菌酯敏感的分离株Fo3_a的转录组。在2728个差异表达基因（DEGs）中，14个参与氧化还原过程和MFS转运蛋白的DEGs在氰烯菌酯耐药菌株中显着上调。另一方面，涉及ATP依赖性RNA解旋酶和核糖体生物发生相关蛋白的14个DEGs在氰烯菌酯耐药和敏感的分离物中均显示出显着下调的表达。这些结果表明，氰烯菌酯不仅严重影响细胞骨架蛋白的结合，而且敏感分离物的ATP酶活性，但也抑制了所有分离物的核糖体生物发生。因此，本研究有助于更好地了解氰烯菌酯的抗性调控机制和杀菌活性，为开发防治Fo的新型杀菌剂提供参考。

材料与方法：
材料：
本研究中使用的分离物列在表S1中，包括真菌性角膜炎患者角膜的Fo分离物Fo3_a，以及来自辣椒，草莓，莲花，香蕉，茄子，西瓜和黄瓜根的其他七种。将所有分离物常规维持在Difco™马铃薯葡萄糖琼脂平板上28°C（PDA，将39g粉末悬浮在1L纯化水中并在121°C高压灭菌15分钟）。对于菌丝生长测定，分离物在PDA板上以28°C生长7天。对于孢子化测定，从3天历史的Fo分离物Fo1st，FoII5和Fo3_a菌落的外围取出15个新鲜的菌丝塞，加入含有150mLDifco™马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）培养基中。

方法：
杀菌剂敏感性测试
将氰烯菌酯加入高压灭菌的PDA培养基中，以测试对菌丝体生长的抑制。从3天龄菌落的边缘取出的菌丝塞（直径5mm）放置在PDA板的中心，用氰烯菌酯修正：0，0.2，0.4，0.8或1.6μg/ mL用于敏感分离物；0、2、4、8 或 16 μg/mL，用于抗性分离株，EC50值作为以前的分类方法。对每种分离株使用每种浓度的三次重复。培养物在28°C下保持7天后，拍摄菌落并测量菌落直径；从每次测量中减去原始菌丝塞的直径（5毫米）。50%有效浓度（EC50）使用DPS v9.01软件通过回归百分比生长抑制对杀菌剂浓度对数计算菌株值。每个实验产生一组EC50s和实验进行了三次。
FoMyo5运动域的序列比对
将所有Fo分离物在PDB中在28°C下培养3天，收集菌丝体并使用研钵和液氮杵精细研磨成粉末。使用E.Z.N.A.真菌RNA试剂盒（Omega Bio-tek，Inc.，Norcross，USA）提取总RNA，并使用PrimeScript™ RT试剂盒（TaKaRa）进行逆转录。使用引物对FoMyo5F/ FoMyo5R从所有Fo分离株的cDNA中扩增FoMyo5运动结构域的序列。然后使用OMEGA BIO-TEK凝胶纯化试剂盒对这些扩增子进行凝胶纯化，克隆到PMD18-T载体中。使用Bioedit 7.2软件对这些FoMyo5运动域进行了对齐。
用于提取RNA的采样
从3 d龄PDB培养物中收集的1株对氰烯菌酯敏感的Fo分离物Fo3_a和2种抗性氰烯菌酯Fo分离物FoII5和Fo1st的孢子24并悬浮在1×10的无菌蒸馏水中6孢子/毫升。将每个分离物的新鲜收获的孢子在两个含有100mL液体YEPD培养基的烧瓶中以175 r / min的速度在28°C的黑暗中培养12 h，并且每个烧瓶接种100μL孢子悬浮液。然后，将10μL 10mg / mL苯那麦克ril加入治疗组的烧瓶中，并使氰烯菌酯的最终浓度为1μg/ mL。将10μL甲醇加入对照组（CK）的烧瓶中，使甲醇的最终浓度为0.1μL / mL。共3个对照分离株和3个处理分离株在28°C下继续培养12小时。 24 h后，收集幼菌丝体，用研钵和液氮杵细磨成粉末，并用上述方法提取总RNA。实验重复了三次，总共得到了18个RNA样本。
RNA-seq文库构建和测序
使用NanoDrop 2000分光光度计检测RNA纯度，并使用生物分析仪2100系统的RNA Nano 6000测定试剂盒评估RNA完整性。使用多T寡核苷酸连接的磁珠从总RNA中纯化mRNA。在第一链合成反应缓冲液（5X）中，利用二价阳离子在高温下进行片段化。使用随机六聚体引物和M-MuLV逆转录酶合成第一条链cDNA，然后使用RNaseH降解RNA。随后使用DNA聚合酶I和dNTP进行第二链cDNA合成。选择优先长度为370-420 bp的cDNA片段，使用AMPure XP系统纯化文库片段。然后用Phusion DNA聚合酶，通用PCR引物和指数（X）引物进行PCR。最后，在分析仪2100系统上纯化了PCR 产物，并评估了文库质量。使用Illumina Novaseq 6000平台对18个cDNA文库进行了测序。
Fo de novo转录组组装和分析
fastq格式的原始读取首先通过内部perl脚本进行处理，得到高质量的数据。Hisat2 v2.0.5用于根据基因模型注释文件将配对端clean reads与臭镰刀鱼NRRL 54006的参考基因组对齐。每个样本的映射读取由StringTie（v1.3.3b）以基于引用的方法进行组装。StringTie使用一种新的网络流算法以及可选的从头组装步骤来组装和定量代表每个基因位点的多个剪接变体的全长转录本。使用功能计数v1.5.0-p3来计算映射到每个基因的读取次数。然后根据基因的长度计算每个基因的FPKM，并读取映射到该基因的计数。
差异表达基因（DEGs）的鉴定和聚类分析
使用DESeq2 R包（1.20.0）比较1 μg/mL氰烯菌酯处理和0.1 μL/mL甲醇处理条件下3株分离株的差异基因表达水平。DESeq2使用基于负二项分布的模型，为确定数字基因表达数据中的差异表达提供了统计例程。使用Benjamini和Hochberg方法来控制错误发现率，对所得到的P值进行了调整。P值调整后<0.05、|log2（FC）|>1的基因分配为显著差异表达的基因，使用Venny 2.1确定DEG数据集中唯一或重叠基因的鉴定以及维恩图的生成。取所有对照组的差异基因作为差异基因集进行采集。使用H簇方法对归一化后差异基因的表达进行聚类，log2（FPKM + 1）。绘制热图，并将热图中具有相似表达模式的基因或样品收集在一起。
差异表达基因的GO、KEGG和PPI分析
通过R（4.1.1）和簇Profiler R包（v4.0.5）对差异表达基因进行基因本体（GO）富集分析。校正P值小于0.05的GO项被认为通过差异表达基因显着富集。使用簇 Profiler R包来测试KEGG通路中差异表达基因的统计富集。基于STRING数据库对差异表达基因的蛋白质蛋白质相互作用网络（PPI）分析，该数据库已知并预测蛋白质-蛋白质相互作用。Cytoscape软件进行可视化编辑。

结果：
表1、尖孢镰刀菌对氰烯菌酯的敏感性和生长速率。AEC50为对菌丝生长抑制50%的杀菌剂浓度。数值为三个实验的平均值±标准差，同一列中的数值后面有相同的字母，经P=0.05，Fisher‘s LSD检验，差异无统计学意义。培养7d后测定B细胞的生长率。根据三个重复计算平均值和标准差。同一封信表明没有显著差异。不同字母表示差异有统计学意义（P=0.05）。

图1、Fo敏感毒株Fo3_a、La0和天然低抗毒株Fo3-2、FoII5、Fo1、CAO0、Fox-KW和FoHGKW的FoMyo5运动区的氨基酸序列与氰烯菌酯的比对分析。垂直方框表示导致氰烯菌酯耐药的151和418处密码子的氨基酸变化。

表2、在1 μg/mL 氰烯菌酯处理和0.1 μL/mL甲醇处理条件下，来自氰烯菌酯敏感和耐药Fo分离株的RNA-Seq数据的映射结果。a 字母“CK”代表用0.1 μL/mL甲醇处理的对照组，其他字母代表用1 μg/mL 氰烯菌酯处理的处理组。字母后的数字代表三个生物学重复。

图2、在1 μg/mL 氰烯菌酯处理期间，氰烯菌酯抗性分离株Fo1st、Fo II5和氰烯菌酯敏感分离株Fo3_a之间的重叠Fo差异表达基因（DEG）。（A）这些Fo分离物中的DEG数。蓝色列表示下调的 DEG数，灰色列表示上调的DEG数。（B）重叠比较组数据集中的DEG维恩图。通过应用调整后的 P值< 0.05 和 |log2（FC）|> 1 的阈值来识别DEG。‘CK’ 代表用0.1 μL/mL甲醇处理的对照组，其他代表用1处理的处理组μg/mL非那麦瑞。

图3、所有对照组中DEG的GO富集分析。比较组（A）Fo3_a vs Fo3_aCK和（B）Fo1st vs Fo1stCK（C）FoII5 vs FoII5CK的散点图中显示了前30个最丰富的GO类别。横坐标代表GO term注释的差异基因数与差异基因总数的比值，纵坐标代表GO term。小圆点的大小代表注释到GO term的基因数量，从红色到紫色的颜色代表富集的显着性，padj < 0.05作为GO富集分析的显着性富集阈值。

图4、所有对照组中DEG的KEGG富集分析。比较组（A）Fo3_a vs Fo3_aCK和（B）Fo1st vs Fo1stCK（C）FoII5 vs FoII5CK 的散点图中显示了前20个最丰富的 KEGG 通路。横坐标代表在KEGG通路上注释的差异基因数与差异基因总数的比值，纵坐标代表KEGG通路。小圆点的大小代表注释到KEGG通路的基因数量，从红色到紫色的颜色代表富集的显着性，padj < 0.05作为KEGG富集分析的显着性富集阈值。

表3、与Fo. 氰烯菌酯的杀菌活性有关的DEG。A“CK”代表用0.1 μL/mL甲醇处理的对照组，其他代表用1 μg/mL 氰烯菌酯处理的处理组。

表4、Fo. 氰烯菌酯耐药调控的DEGs a NA表示没有显着差异或未检测到基因的表达水平。倍数变化值由log2比率表示。“CK”代表用0.1 μL/mL甲醇处理的对照组，其他代表用1 μg/mL 氰烯菌酯处理的处理组。

结论：
在这项研究中，发现FoMyo5中的氨基酸取代（V151A和S418T）导致植物病原Fo分离株对非那麦瑞的天然低抗性。通过对氰烯菌酯处理1 μg/mL后氰烯菌酯耐药和敏感菌株的比较转录组分析，鉴定了一系列可能与氰烯菌酯的耐药性调节和杀真菌活性相关的DEG。这些基因参与氧化还原过程、MFS转运蛋白、ATP依赖性RNA解旋酶和核糖体生物发生相关蛋白。这些结果表明，氰烯菌酯不仅严重影响敏感分离株的细胞骨架蛋白结合和ATP酶活性，而且抑制了所有分离株的核糖体生物合成。该研究为深入了解氰烯菌酯对Fo的抗性调控机制和杀菌活性提供了依据，为开发新型杀菌剂防治Fo引起的病害提供了参考。