Functional genomics analysis reveals two novel genes required for littorine biosynthesis

功能基因组学分析揭示了两个Littorine生物合成所需的新基因，基因组挖掘很有效果~

摘要

一些茄科药用植物能够生产药用莨菪烷类生物碱（TAs），如莨菪碱和东莨菪碱。Littorine（littorine）是莨菪碱和东莨菪碱生物合成途径中的一个关键中间产物。然而，从前体苯基乳酸（phenyllactate）和莨菪烷醇（tropine）形成Littorine的机制尚不完全清楚。 在本研究中，我们通过功能基因组学方法揭示了Littorine的生物合成途径，并功能性地鉴定了两个新的生物合成基因，这些基因编码苯基乳酸UDP-糖基转移酶（UGT1）和Littorine合酶（LS）。 UGT1和LS在颠茄（Atropa belladonna）的侧根中高度且特异性地表达。抑制UGT1或LS中的任何一个基因都会中断Littorine及其TA衍生物（莨菪碱和东莨菪碱）的生物合成。纯化的His标签的UGT1催化苯基乳酸糖基化形成苯基乳糖苷。如果添加莨菪烷醇和苯基乳酸，UGT1和LS在烟草叶中的共表达会导致Littorine的合成。 UGT1和LS的鉴定为Littorine生物合成提供了缺失的环节。研究结果为通过代谢工程或合成生物学手段生产用于医疗用途的莨菪碱和东莨菪碱铺平了道路。

介绍

自古以来，包括颠茄（Atropa belladonna）、曼陀罗（Datura stramonium）和天仙子（Hyoscyamus niger）在内的茄科药用植物就因其所含莨菪烷类生物碱（TAs）——莨菪碱和东莨菪碱——具有抗胆碱能活性而被用于治疗各种疾病（Kohnen-Johannsen & Kayser, 2019；Humphrey & O'Hagan, 2001）。因此，长期以来人们对阐明TA的生物合成途径有着浓厚的兴趣。与TA生物合成相关的大多数酶促反应已经被表征，包括腐胺N-甲基转移酶（PMT）、N-甲基腐胺氧化酶（MPO）、III型多酚合酶（PYKS）、托品酮合酶（CYP82M3）、莨菪烷醇形成还原酶（TRI）、芳香族氨基酸氨基转移酶（AT4）、苯丙酮酸还原酶（PPAR）、Littorine变位酶（CYP80F1）和莨菪碱6β-羟化酶（H6H）（Li et al., 2006, 2012; Katoh et al., 2007; Bedewitz et al., 2014, 2018; Qiang et al., 2016; Geng et al., 2018; Qiu et al., 2018）（图1）。然而，Littorine和莨菪碱形成的酶促反应尚未揭示。

莨菪烷类生物碱（TAs）在茄科植物中的生物合成途径。

PMT，腐胺N-甲基转移酶；MPO，N-甲基腐胺氧化酶；PYKS，III型多酚合酶；CYP82M3，托品酮合酶；TRI，托品酮还原酶I；AT4，芳香族氨基酸氨基转移酶4；PPAR，苯丙酮酸还原酶；UGT1，苯基乳酸UDP-糖基转移酶；LS，Littorine合酶；CYP80F1，Littorine变位酶；H6H，莨菪碱6β-羟化酶。

Littorine是一种莨菪烷类生物碱，是莨菪碱和东莨菪碱生物合成中的关键中间产物（Hashimoto et al., 1993; Robins et al., 1994a）。它是由莨菪烷醇和苯基乳酸之间的酯化反应生成的（Robins et al., 1994b）。由于这些化合物非常稳定，莨菪烷醇（酰基受体）和苯基乳酸（酰基供体）之间的酯化反应不太可能发生。在Littorine的生物合成中，莨菪烷醇是酰基受体，而富含能量或被激活的苯基乳酸是酰基供体。通常，在生物体内的酰基供体是富含能量的酰基辅酶A硫酯或1-O-β-葡萄糖酯（Bontpart et al., 2015）。酰基辅酶A硫酯可由辅酶A连接酶使用特定底物和辅酶A产生。例如，苯甲酰辅酶A在可卡因的生物合成中被BAHD酰基转移酶用作酰基供体（Schmidt et al., 2015）。此外，1-O-β-葡萄糖酯可以通过UDP-糖基转移酶（UGT）使用特定底物和UDP-葡萄糖生成（Schulenburg et al., 2016; Zhao et al., 2016）。先前的研究已鉴定出颠茄（A. belladonna）中产生乙酰假莨菪碱、异戊烯基假莨菪碱和苯乙酰假莨菪碱的酶，但未发现生成乙酰莨菪烷或苯乙酰莨菪烷的酶（Robins et al., 1994c），这表明BAHD酰基转移酶参与假莨菪烷的酰基修饰，而不参与莨菪烷的修饰。因此，糖基化苯基乳酸（苯基乳糖苷）可能是莨菪烷的酰基供体，当由丝氨酸羧肽酶（SCP）样酰基转移酶（SCPL-ATs）催化时，莨菪烷和苯基乳糖苷可能会缩合生成Littorine，这种酶催化特定化合物和1-O-β-葡萄糖酯之间的酯化反应（Li & Steffens, 2000）。

材料与方法

生物信息学分析

利用UGTs（PF00201）和SCP与SCPL-ATs（PF00450）的隐马尔可夫模型（HMM）蛋白结构域，使用HMM搜索程序在密歇根州立大学发布的颠茄（Atropa belladonna）转录组中筛选候选基因（Medicinal Plant Genomics Resource）。利用UGT/SCP单基因和所有已知的TA生物合成基因的FPKM值，在Multiple Experiment Viewer（MeV）软件（Saeed et al., 2003）中基于层次聚类分析（Eisen et al., 1998）生成数字组织表达谱。使用Mega7中的ClustalX算法生成邻接法系统发育树，其中所有拟南芥UGTs和已知的植物SCPL-ATs用作参考（Kumar et al., 2016）。

UGT1和LS的克隆

使用PrimeScript Kit（TaKaRa，北京，中国）从颠茄的侧根中提取的mRNA合成cDNA。使用fUGT1和rUGT1引物对UGT1，以及fLS和rLS引物对LS（参见补充信息表S1）扩增cDNA序列。PCR使用HyPerFUsion™ DNA聚合酶（APExBIO Technology, Houston, TX, USA）进行。PCR产物被亚克隆到pJET1.2载体（ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA）并测序。

基因表达分析

使用PGK作为内参基因，通过qPCR分析UGT1和LS的组织表达谱（至少有三个生物学重复）（Li et al., 2014）。从4个月大的颠茄植株的侧根、主根、茎和叶中提取RNA，并使用天根生物科技有限公司（北京，中国）的试剂盒进行cDNA合成。SYBR qPCR Mix购自诺维信（上海，中国）。qPCR使用IQ5系统（Bio-Rad, Hercules, CA, USA）进行，还用于评估基因沉默幼苗和RNAi根培养物中UGT1和LS的表达。本研究中使用的所有引物列于表S1中。qPCR分析所用引物的效率使用LinRegPCR评估（Ramakers et al., 2003）（表S1），其特异性通过熔解温度评估（图S1）。

病毒诱导的基因沉默（VIGS）

将495-bp的UGT1片段和582-bp的LS片段分别插入烟草脉带病毒（TRV）载体（pTRV2）中，使用限制性内切酶XhoI和KpnI构建pTRV2-UGT1和pTRV2-LS载体。这些载体分别引入根癌农杆菌GV3101。UGT1/LS沉默在年轻的颠茄幼苗中进行，如前述（Bedewitz et al., 2018）。28天后，收集地下部分进行基因表达分析，地上部分用于莨菪碱检测（Lan et al., 2018; Qiu et al., 2018）。

RNAi基因抑制在根培养物中的应用

将495-bp的UGT1-RNAi片段和486-bp的LS-RNAi片段分别插入pBin19以生成pBin19-UGT1和pBin19-LS RNAi载体。构建pBin19-UGT1和pBin19-LS RNAi载体的方法在补充信息中有详细描述（图S2, S3）。这些载体分别引入携带pRiA4的根癌农杆菌C58C1（Moyano et al., 2002; Zhang et al., 2004）。建立UGT1-RNAi、LS-RNAi和对照根培养物，并按照先前描述的方法进行培养（Yang et al., 2011）。感兴趣的基因rolB, rolC, NPTII, 35S::UGT1, 和35S::LS通过PCR检测（Qiu et al., 2018）。UGT1和LS的表达分析如前所述的qPCR方法。基因表达和代谢物分析使用在无抗生素的液体Murashige和Skoog（MS）培养基中培养30天的根系培养物（Qiu et al., 2018）。

颠茄根培养物中代谢物的定量

按照之前描述的方法定量苯基乳酸、Littorine、莨菪碱和东莨菪碱（Bedewitz et al., 2014, 2018），做了一些修改。对照、UGT1-RNAi和LS-RNAi根培养物经过冷冻干燥和研磨，取25 mg用于提取（Qiu et al., 2018）。

使用Waters UPLC-Xevo TQD质谱仪和Acquity UPLC BEH C18柱（2.1 mm × 50 mm, 1.7 μm）定量Littorine、

莨菪碱和东莨菪碱（进样体积2 μl）。样品通过二元梯度洗脱（0.1%甲酸水溶液（A）和乙腈（B））分离。流速为0.4 ml min−1，柱温为40°C。洗脱程序见表S2。使用电子喷雾电离（ESI）正离子模式和优化的多反应监测（MRM）转变进行测量（表S3）。仪器参数：源电压3.0 kV，源温500°C，气流1000 l h−1，锥孔50 l h−1。

苯基乳酸（进样体积8 μl）使用上述超高效液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）系统定量（使用相同的流动相和仪器参数），但采用不同的色谱柱（Symmetry C18 Column, 2.1 mm × 100 mm, 3.5 μm）。洗脱程序见表S4。使用负离子模式的ESI全扫描和优化的MRM转变进行测量（表S5）。

此外，准备100 mg冻干并研磨的根粉，用于莨菪烷的定量。使用先前报道的方法提取和分析（Richter et al., 2005）。使用Shimadzu的GCMS-QP2010系统配备Rtx-5柱（30 m × 0.25 mm, 0.25 μm）。参数：离子源温度230°C，氦载气流速1.05 ml min−1。温度程序：从65°C开始，以10°C min−1的速率升至150°C，保持2分钟，再以10°C min−1的速率升至280°C，保持10分钟。进样在分流模式下进行，进样口温度为250°C，进样量为9 μl。

His标签UGT1的纯化和酶促分析

UGT1编码序列（CDS）使用限制性内切酶BamHI和HindIII插入pET28a。His标签UGT1在工程化大肠杆菌中表达。培养物在与前述条件完全相同的条件下诱导和收获（Qiu et al., 2018）。His标签UGT1使用HisPur Ni-NTA树脂（ThermoFisher Scientific）进行纯化（Qiu et al., 2018）。纯化后，新鲜蛋白立即用于酶促分析。反应系统（200 μl）包含10 μg纯化的UGT1，1 mM苯基乳酸，5 mM UDP-葡萄糖，5 mM氯化锰，Tris-HCl（pH 7.2）。煮沸的UGT1作为对照。30°C反应120分钟后，反应混合物上清液（1 μl）使用四极杆飞行时间（QTOF）质谱仪（Bruker Impact II，德国卡尔斯鲁厄）分析。样品通过Symmetry C18柱（2.1 mm × 100 mm, 3.5 μm）分离，洗脱程序见表S6。化合物使用ESI全扫描负离子模式检测，仪器参数设定为：毛细管电压3.0 kV，干燥加热器温度180°C，雾化器压力0.4 Bar，干气流速率4.0 l min−1。

蛋白质印迹（Western Blot）

LS CDS与C末端HA标签融合并插入pEAQ-HT（Zhao et al., 2016），以生成在烟草叶细胞中瞬时表达的载体。遗传转化和蛋白质印迹按先前描述的方法进行（Zhang et al., 2015），使用HA抗体。

通过重建烟草细胞中的Littorine生物合成进行LS的功能鉴定

分别将YFP（对照）、UGT1和LS的全长CDS克隆到pEAQ-HT载体中，使用限制性内切酶AgeI和XhoI，生成pEAQ-YFP、pEAQ-UGT1和pEAQ-LS载体，并分别转入根癌农杆菌GV3101。烟草叶片用细菌渗入，代谢物按先前描述的方法提取（Lau & Sattely, 2015），稍有改动，渗入溶液中使用1 mM莨菪烷醇和1 mM苯基乳酸。代谢物使用LC-30AD UPLC系统（岛津）和AB Sciex Triple Quad 5500质谱仪检测。样品通过Symmetry C18柱（2.1 mm × 100 mm, 3.5 μm）分离，柱温40°C，使用0.1%甲酸水溶液（A）和乙腈（B）进行二元梯度洗脱。流速为0.4 ml min−1。洗脱程序见表S7。测量使用ESI正离子模式和优化的MRM转变（表S8）。仪器参数：离子喷射电压5.5 kV；源温500°C；幕气40 psi；离子源气50 psi。

结果与讨论

为了寻找参与Littorine生物合成的候选基因（UGT1和LS），进行了生物信息学分析。利用UGT保守结构域（PF00201）搜索颠茄（A. belladonna）转录组，鉴定出102个单基因（表S9）。利用SCPL-ATs和SCP中的保守结构域（PF00450）（它们都属于α/β水解酶超家族）搜索颠茄转录组，获得了33个单基因（表S9）。TAs在侧根中合成，而已知的TA生物合成基因在这些侧根中特异性或高度表达（Suzuki et al., 1999; Bedewitz et al., 2014, 2018; Qiu et al., 2018）。102个UGT基因中有7个，以及33个SCP基因中的2个表现出与已知TA生物合成基因相似的组织表达谱（图S4，S5）。其中2个UGT基因在无菌幼苗中未表达，而在这些幼苗中检测到了TAs，这表明它们可能不参与TA的生物合成。对另外5个UGT基因与所有拟南芥UGT进行了系统发育分析（图S6）。aba_locus_19485单基因与两个拟南芥UGT（AT4G15480.1和AT3G21560.1）聚在一起，这两个基因催化结构相似的苯丙素类的C1-糖基化（Lim et al., 2001）。苯基乳酸的结构与这些拟南芥UGT使用的苯丙素底物相似。因此，aba_locus_19485被假设为苯基乳酸UDP-糖基转移酶（命名为UGT1）。在两个SCP基因中，aba_locus_17884（命名为Littorine合酶，LS）在无菌幼苗中表达，而aba_locus_128152则未表达，因此前者是唯一可能导致Littorine生成的SCPL-AT候选基因。系统发育分析显示，LS与SCPL-ATs聚在一起（图S7），这些SCPL-ATs通过酯化将酰基受体和苯丙素葡萄糖酯（酰基供体）结合在一起（Lehfeldt et al., 2000; Shirley & Chapple, 2003; Noda et al., 2006; Fraser et al., 2007; Weier et al., 2008），这表明LS可能具有与已知SCPL-ATs相似的功能。UGT1和LS的序列从颠茄侧根mRNA合成的cDNA中克隆出，其序列已存入GenBank，登录号分别为MN256145和MN256146。数字基因表达的进一步分析证实了UGT1和LS的组织表达谱与已知的TA生物合成基因相似（图2a）。组织表达谱通过qPCR验证（图2b, c），表明它们在颠茄侧根中高度或特异性表达。

莨菪烷类生物碱（TA）生物合成基因的组织表达谱及UGT1/LS在颠茄幼苗中的病毒诱导基因沉默（VIGS）。 (a) 颠茄不同器官中TA生物合成基因的数字基因表达。 (b) UGT1在颠茄中的组织表达谱。 (c) LS在颠茄中的组织表达谱。柱上的不同字母表示Duncan检验的显著性差异（P < 0.05）。SR，侧根；PR，主根；S，茎；L，叶。 (d) 颠茄根中UGT1的表达。TRV2，对照；TRV2-UGT1，UGT1被沉默的植株。，P < 0.001（t检验）。 (e) 颠茄根中LS的表达。TRV2，对照；TRV2-LS，LS被沉默的植株。，P < 0.001（t检验）。 (f) 莨菪碱的生成。TRV2，对照；TRV2-UGT1，UGT1被沉默的植株；TRV2-LS，LS被沉默的植株。数据表示为均值±标准差。***，P < 0.001（t检验）。

最近使用病毒诱导的基因沉默（VIGS）方法在颠茄中鉴定了几种新的TA生物合成基因（AT4、PYKS和CYP82M3）（Bedewitz et al., 2018）。通常，当一个TA生物合成基因被沉默时，TA的产量会大大减少（Bedewitz et al., 2018）。在本研究中，UGT1和LS在颠茄幼苗中分别被沉默，以研究它们在TA生物合成中的作用。在基因沉默的幼苗根部，UGT1/LS的转录水平显著下降（图2d,e）。莨菪碱是颠茄中的主要生物碱（Xia et al., 2016），通常用作标记生物碱。在基因沉默的植株中，莨菪碱的生成量显著减少（图2f），这表明UGT1和LS参与了莨菪碱的生物合成。

为了确认UGT1和LS在TA生物合成中的作用，构建了分别利用RNAi抑制UGT1和LS的转基因颠茄根培养物（图S8）。在RNAi根培养物中，UGT1/LS的表达显著下降（图3a）。RNAi株系中的TA产量（Littorine、莨菪碱和东莨菪碱）远低于对照组；在两个LS-RNAi株系（ILS-1和ILS-5）中检测到了微量的三种TA。在对照组中，Littorine含量为234.00 μg/g干重（DW），在UGT1-RNAi根培养物中为16.65–50.31 μg/g DW（图3b），相当于对照组Littorine含量的7.1–21.5%。LS的抑制使Littorine含量更显著地降低至0.09–4.12 μg/g DW（图3b），相当于对照组Littorine含量的0.04–1.76%。因此，RNAi抑制UGT1或LS中的任何一个基因都会破坏Littorine的生成。由于中间化合物Littorine的供应减少，UGT1-RNAi和LS-RNAi根培养物中的莨菪碱和东莨菪碱的产量也显著降低。在对照根培养物中，这些化合物的水平分别为3.01 mg/g DW和0.83 mg/g DW（图3c,d）。UGT1的抑制分别导致0.11–0.43和0.05–0.21 mg/g DW的水平（图3c,d），而LS的沉默则分别导致0.009–0.11和0.002–0.029 mg/g DW的水平（图3c,d）。这些进一步确认了这两个基因确实参与了TA的生物合成。

UGT1/LS抑制对莨菪烷类生物碱（TAs）生物合成及其前体在颠茄根培养物中积累的影响。 (a) UGT1和LS的表达。 (b) Littorine，(c) 莨菪碱，(d) 东莨菪碱，(e) 莨菪烷醇，(f) 苯基乳酸的水平。对照组为表达空pBin19载体的根培养物；IUGT1为使用RNAi抑制UGT1的根培养物；ILS为使用RNAi抑制LS的根培养物。柱状图上的误差线表示标准差（SD，n ≥ 3）。数据表示为平均值±SD。，P < 0.05；，P < 0.01；，P < 0.001（t检验）。

通常，抑制生物合成基因会导致目标代谢物的某些前体在更高水平上积累。此前，当分别抑制AbPYKS和AbCYP82M3时，其底物（分别为N-甲基-Δ1-吡咯盐和4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸）的积累显著增加（Bedewitz et al., 2018）。因此，在颠茄根培养物中也分析了苯基乳酸和莨菪烷醇的积累。UGT1或LS的抑制显著增加了根培养物中莨菪烷醇的积累，可能是因为更少的莨菪烷醇被代谢为Littorine（图3e）。LS的抑制还显著增加了苯基乳酸的积累，但UGT1的抑制则没有（图3f）。许多UGT催化结构相似底物的糖基化（Lim et al., 2004；Torrens-Spence et al., 2018；Sun et al., 2018）。在本研究中，UGT1可能不是唯一将苯基乳酸转化为苯基乳糖苷的UGT，因为其他未鉴定的颠茄UGT也可能会产生少量苯基乳糖苷用于Littorine的生物合成。另一种可能性是，与LS-RNAi构建相比，UGT1-RNAi构建中TA的减少效率较低，不足以引起苯基乳酸的积累。同样，抑制AbPPAR显著减少了其直接产物（苯基乳酸），并严重扰乱了TA的生物合成，但其底物（苯丙酮酸）的积累却没有变化（Qiu et al., 2018）。

为了鉴定催化活性，在大肠杆菌中表达了N端His标签的UGT1并进行纯化用于酶促分析。在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）上出现了一个分子量（MW）为58.1 kDa的单一蛋白条带，与其预测的MW一致（图4a）。当反应体系中同时提供苯基乳酸和UDP-葡萄糖给UGT1酶时，形成了一个新产物，被鉴定为苯基乳糖苷（m/z 327.1088）（图4c,d），这是通过液相色谱-质谱（LC-MS）确认的。阴性对照（煮沸的UGT1）未生成苯基乳糖苷（图4b）。这些数据表明UGT1使用苯基乳酸和UDP-葡萄糖催化苯基乳糖苷的形成。由于缺乏市售的苯基乳糖苷，未对UGT1的动力学进行分析。由于产量低，无法分离出足够的UGT1生成的苯基乳糖苷进行LS酶促分析，这是随后通过植物体内瞬时表达方法鉴定LS功能的主要原因。

UGT1和LS的功能鉴定。 (a) 纯化的His标签UGT1。1，蛋白质标准；2，纯化的His标签UGT1蛋白。 (b) 控制（煮沸）UGT1介导的反应系统的提取离子色谱（EIC）图。 (c) UGT1介导的反应系统的EIC图。 (d) 从(c)中提取的3.80分钟的质谱数据。 (e) 在烟草细胞中异源表达的LS-HA检测。NC，阴性对照；VC，载体对照；LS-HA，在烟草叶细胞中表达的C末端融合有HA标签的LS。 (f–j) 使用UPLC-MS/MS和烟草叶细胞获得的代表性MRM图谱。(f) 莨菪烷醇和Littorine标准品。(g) 共同表达UGT1和LS的烟草叶细胞。(h) 表达LS和YFP的烟草叶细胞。(i) YFP对照。(j) 表达UGT1和YFP的烟草叶细胞。

从大肠杆菌中纯化的重组SCPL-ATs通常由于缺乏翻译后修饰而失去其催化活性（Shirley & Chapple, 2003; Stehle et al., 2008; Weier et al., 2008）。值得注意的是，SCPL-ATs可能被加工成不同的亚基，但这种加工机制完全未知。为了评估LS是否在植物体内被加工成亚基，将C末端HA标签的LS基因短暂表达于烟草叶片中。蛋白质印迹显示从表达LS的烟草叶细胞中获得了两条条带，而在对照烟草叶细胞中未检测到任何条带。一条条带显示的分子量（MW）为55.1 kDa，与HA标签LS的预测MW一致，另一条条带显示为36 kDa，远小于HA标签LS的预测MW（图4e）。这表明LS在植物细胞中经过翻译后加工。先前，在异源SCPL-AT表达后，检测到未经加工和加工后的SCPL-ATs（Li & Steffens, 2000; Mugford et al., 2009）。然而，在含有SCPL-ATs的天然植物中仅检测到加工后的SCPL-ATs。例如，在燕麦根细胞中仅检测到加工后的燕麦SCPL-AT（SAD7），但在异源表达SAD7的烟草细胞中同时检测到未经加工和加工后的SAD7（Mugford et al., 2009）。由于LS被加工成亚基，使用瞬时表达方法确认了LS的功能。烟草不产生TAs，这一特性被用来鉴定TA生物合成基因（Bedewitz et al., 2018）。

当UGT1和LS在烟草细胞中共同表达，并添加莨菪烷醇和苯基乳酸时，在保留时间为5.45分钟检测到Littorine（图4g），与标准Littorine一致（图4f）。当仅在烟草叶细胞中表达LS时，也检测到微量的Littorine（图4h），这表明烟草中未知的UGT酶可能将苯基乳酸转化为其糖基化酯。通常，许多UGT可以接受具有相似结构的化合物（Cui et al., 2016; Wang et al., 2019）。值得注意的是，与仅表达LS的细胞相比，共同表达UGT1和LS的烟草叶细胞中Littorine的水平高出约10倍。表达黄色荧光蛋白（YFP）对照（图4i）或UGT1的烟草叶细胞未产生Littorine（图4j）。这些数据表明LS负责Littorine的生成。在可卡因树代表性的莨菪烷类生物碱——可卡因的生物合成中，BAHD酰基转移酶在古柯属（Erythoxylum coca）中通过酯化将甲基卡因和CoA活化的苯甲酸结合生成可卡因（Schmidt et al., 2015）。可卡因和Littorine的生物合成之间的差异与莨菪烷类生物碱在古柯科和茄科植物中独立进化的提议一致（Jirschitzka et al., 2012）。

综上所述，鉴定出两个Littorine生物合成所需的新基因。一个是UGT1，它催化苯基乳酸和UDP-葡萄糖连接生成苯基乳糖苷；另一个是Littorine合酶（LS），它通过酯化将苯基乳糖苷和莨菪烷醇结合生成Littorine。本研究为通过合成生物学或代谢工程生产莨菪烷类生物碱提供了有价值的基因。