易基因｜DNA甲基化揭示肌痛性脑脊髓炎/慢性疲劳综合征在复发和恢复周期中的动态表观变化

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2022年10月06日，《Int J Mol Sci》杂志发表题为“Dynamic Epigenetic Changes during a Relapse and Recovery Cycle in Myalgic Encephalomyelitis/Chronic Fatigue Syndrome”的研究论文，该研究通过简化基因组甲基化测序（RRBS）等实验揭示DNA甲基化可以作为肌痛性脑脊髓炎/慢性疲劳综合征（ME/CFS）疾病变异的表观标记物，提示ME/CFS在复发-恢复周期的动态表观遗传学变化。

标题：Dynamic Epigenetic Changes during a Relapse and Recovery Cycle in Myalgic Encephalomyelitis/Chronic Fatigue Syndrome

时间：2022.10.06

期刊：International Journal of Molecular Sciences

影响因子：IF 6.208

技术平台：RRBS

研究设计

从两名ME/CFS患者和健康年龄匹配的对照组在11个月内的5个间隔时间点采集血液，这5个时间点绘制了ME / CFS患者复发的典型受损健康状态（图1A）。

使用差异甲基化分析包（DMAP）平台分析来自三个受试者的5个样品中的每一个RRBS数据，对每个患者和对照鉴定了每个样本的可变甲基化片段（IVMF）（图1B），并命名为ME-iVMFs。适合分析的片段具有至少2个CpG位点的10个或更多reads覆盖。

图1：研究设计

研究对象通过复发和相对恢复周期自我报告的健康状况进行总结。两名患者在11个月内的复发时间表及匹配对照的健康状况。患者在抽血当天提供自我报告信息表明其健康状况（在–3~10之间）。

纵向分析的研究设计。在简化基因组DNA甲基化测序（RRBS）之后，使用Bismark进行adaptor trimming并将数据与人类参考基因组hg19进行比对（alignment），随后对患者组和对照组的每个样本进行分析和比较。利用全基因组CpG甲基化信息进行初始评估后，使用DMAP平台分析样本并利用卡方检验来鉴定甲基化变化。在关键基因组位置的片段甲基化也用于评估变化。继续分析使用了所有15个样本中鉴定的577个具有统计学意义的可变片段（FDR校正p<0.05），其中通过健康评分和“复发”和“恢复”事件计算相关性，以鉴定每个样本的可变甲基化片段（iVMFs）。确定了与iVMFs相关的基因并研究了功能类别。#见图2，##见图3，###见表1和表2，####见图5。

结果图形

（1）DNA甲基化动态变化分析

图2：每位受试者计算的变化线图

两名ME/CFS患者和健康对照，在a~e每个时间点的显著统计学特异性差异甲基化CpG位点线图。

X轴上指示的基因特征上为每个样本计算的变异性得分线图。

与CpG岛相关的X轴上指示特征的每个样本计算的变异性得分线图。

（2）患者常见的ME-iVMFs甲基化模式

图3：感兴趣的ME-iVMFs的甲基化变化热图。

所有15个样本中检测到的577个具有统计学意义的ME-iVMFs的甲基化百分比变化。

68个ME-iVMFs中的甲基化变化，其中P1和C组之间的平均甲基化差异大于15%。

53个ME-iVMFs中的甲基化变化，其中P2和C组之间的平均甲基化差异大于15%。

图右侧与（B）（C）相关的点图显示了不同甲基化程度。图3A下方的刻度显示了与甲基化分数相关的相应颜色。 P1：patient 1；P2：patient 2。

（3）鉴定与复发条件相关的甲基化模式

表1：与P1复发条件相关的片段。

显示的片段皮尔逊相关系数至少为0.9，“复发”和“恢复”时间点之间的平均甲基化差异至少为15%。该表描述了每个片段的位置，以及适当的基因id。它列出了Genehancer中记录的所有重叠调控元件（启动子/增强子）以及使用UCSC基因组浏览器鉴定的与调控相互作用簇相关的基因id。此外该表显示了每个片段每个时间点（P1-a至P1-e）记录的甲基化百分比，复发时间点用斜体表示。

表2：与P2复发条件相关的片段。

显示的片段皮尔逊相关系数至少为0.9，“复发”和“恢复”时间点之间的平均甲基化差异至少为15%。该表描述了每个片段的位置和基因id（如果合适）。它列出了Genehancer中记录的所有重叠调控元件（启动子/增强子）以及使用UCSC基因组浏览器鉴定的与调控相互作用簇相关的基因id。此外该表显示了每个片段每个时间点（P2-a–P2-e）记录的甲基化百分比，复发时间点用斜体表示。复发状态下高甲基化的片段以粗体显示。

（4）与对照相比，复发相关的甲基化标记显示出显著变化

图4： DNA甲基化动态变化与患者自我报告的健康状况相关。每个感兴趣片段的甲基化百分比片段坐标显示在a~e所有五个时间点的区块上方，如果片段直接与基因特征（内含子/外显子）重叠，则基因id显示在括号中。

P1绿色表示复发期

P2橙色表示在一次血液采样中捕获的复发期。

（5）对照组的模拟复发发现可变甲基化基因少于患者组

图5：与复发相关的ME-iVMFs相关基因研究。

与对照组的“模拟”复发事件相关的每个具有统计学意义的可变甲基化片段相关的基因数量箱线图（在使用每个患者复发时间点的两次分析中），并以红色显示了两名患者的“实际复发事件”。每个点代表一个片段，y轴上显示了相关基因的数量。患者组和对照组的已鉴定片段相关的基因平均数用水平线表示。未配对t检验的显著性值为p=0.0053。

Sankey图显示了在与复发事件相关的每个患者中鉴定的可变甲基化片段与它们通过相关基因的各种调控基因组元素关联的生物学功能之间的关系。为每个样本鉴定的具有统计学意义的可变甲基化片段中确定位置，并从UCSC基因组浏览器中记录相关的调控相互作用。编制了与这些调控相互作用相关的基因列表，并利用功能注释将其分类。一些基因分为多个类别，而另一些基因则没有已知的功能。

结论：

本研究显示了精准医学对像ME/CFS这样生理复杂疾病患者的益处。目前ME/CFS患者对特定药物（包括维生素B12等补充剂、纳曲酮等抗炎药等）的反应可能有很大差异，以及怀孕等生理状态，有些症状明显改善，有些症状显著恶化，有些症状似乎没有变化。通过考虑ME/CFS疾病过程中的个别患者，不仅可以更好地了解整个患者群体中的相似性，还可以深入了解每个患者与特定病理生理学相关的波动。在这项研究中，复发条件相关调控区域的可变甲基化鉴定出许多在免疫、炎症、代谢和线粒体通路中具有关键功能作用的基因。对于一种已证明具有诊断和表征挑战性的疾病，由于诊断延迟对受影响的人有害，这种分析不仅提供了严重生物功能障碍的进一步证据，更重要的是，随着继续解开和理解ME/CFS的复杂性质，持续的系统分子变化为个体治疗或症状管理的未来目标提供了信息。

图6：ME/CFS患者纵向时间表摘要。

ME/CFS的最初外部触发因素是遗传易感人群中的“应激事件”（如病毒感染-图6左上角）。在进展到慢性状态后，患者会经历频繁的复发事件，正如本研究所表明的，这主要与许多关键生物系统的上调有关。

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简化甲基化测序(Reduced Representation Bisulfite Sequencing,RRBS)是利用限制性内切酶对基因组进行酶切，富集启动子及CpG岛等重要的表观调控区域并进行重亚硫酸盐测序。该技术显著提高了高CpG区域的测序深度，在CpG岛、启动子区域和增强子元件区域可以获得高精度的分辨率，是一种准确、高效、经济的DNA甲基化研究方法，在大规模临床样本的研究中具有广泛的应用前景。

为适应科研技术的需要，易基因进一步开发了可在更大区域内捕获CpG位点的双酶切RRBS(dRRBS)，可研究更广泛区域的甲基化，包括CGI shore等区域。

为助力适用低起始量DNA样本（5ng）量多维度甲基化分析，易基因开发了富集覆盖CpG岛、启动子、增强子、CTCF结合位点的甲基化靶向基因组测序方法：extended-representation bisulfite sequencing（XRBS），实现了高灵敏度和微量样本复用检测，使其具有高度可扩展性，并适用于有限的样本和单个细胞基因组CG位点覆盖高达15M以上。

技术优势：

起始量：100ng gDNA；

单碱基分辨率；

多样本的覆盖区域重复性可达到85%-95%、测序区域针对高CpG调控区域，数据利用率更高；

针对性强，成本较低；

基因组CG位点覆盖高达10-15M，显著优于850K芯片。

应用方向：

RRBS/dRRBS/XRBS广泛应用于动物，要求全基因组扫描（覆盖关键调控位点）的：

队列研究、疾病分子分型、临床样本的甲基化 Biomarker 筛选

复杂疾病及肿瘤发病机制等甲基化研究

模式动物发育和疾病甲基化研究

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参考文献：

Helliwell AM, Stockwell PA, Edgar CD, Chatterjee A, Tate WP. Dynamic Epigenetic Changes during a Relapse and Recovery Cycle in Myalgic Encephalomyelitis/Chronic Fatigue Syndrome. Int J Mol Sci. 2022 Oct 6;23(19) pii: ijms231911852.