易基因｜METTL3 通过调节m6A 修饰抑制口腔鳞状细胞癌安罗替尼敏感性| 肿瘤研究

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2022年9月27日，中山大学附属第一医院口腔颌面外科王安训和何倩婷课题组在《Cancer Cell International》杂志发表了《METTL3 suppresses anlotinib sensitivity by regulating m6A modifcation of FGFR3 in oral squamous cell carcinoma》的研究论文，该研究通过MeRIP-seq等技术揭示METTL3 通过调节口腔鳞状细胞癌中 FGFR3 的m6A 修饰来抑制安罗替尼敏感性。

标题：METTL3 suppresses anlotinib sensitivity by regulating m6A modifcation of FGFR3 in oral squamous cell carcinoma

时间：2022.09.27

期刊：Cancer Cell International

影响因子：IF 6.429

技术平台：MeRIP-seq（m6A-seq）

研究思路：

研究摘要：

背景

N6甲基腺苷（m6A）是mRNA中一种丰富的核苷酸修饰，但对其在癌症药物敏感性和耐药性中的作用研究很少。在此前研究中，安罗替尼（Anlotinib）已被证明在口腔鳞状细胞癌（OSCC）中具有有效的抗肿瘤作用。本研究旨在研究安罗替尼的治疗靶点以及m6A修饰在OSCC中调节安罗替尼作用的功能和机制。

方法

安罗替尼治疗具有剂量依赖性特点，本研究采用western blotting、qRT-PCR和细胞功能丧失试验用于研究安罗替尼在OSCC中的治疗靶点。使用RNA m6A斑点杂交分析、m6A-MeRIP-seq和MeRIP-qPCR、RNA和蛋白质稳定性试验来分析安罗替尼治疗靶点的m6A修饰。在METTL3敲除后进行细胞功能丧失试验以研究m6A修饰水平对安罗替尼在OSCC中治疗效果的影响。采用患者来源的肿瘤异种移植模型（PDX）和免疫组化染色研究METTL3与安罗替尼体内抗肿瘤敏感性的关系。

结果

安罗替尼在OSCC治疗中靶向FGFR3，通过失活FGFR3/AKT/mTOR信号通路抑制肿瘤细胞增殖并促进凋亡。METTL3被鉴定为靶向并修饰FGFR3 m6A甲基化，然后降低mRNA稳定性。METTL3表达水平与体外OSCC细胞中的安罗替尼敏感性相关，METTL3敲除通过抑制FGFR3表达促进OSCC细胞的安罗替尼敏感性。PDX模型样本进一步表明METTL3和FGFR3水平与OSCC中安罗替尼疗效密切相关。

结论

本研究表明FGFR3作为安罗替尼的治疗靶点，METTL3介导的FGFR3 m6A修饰在OSCC中安罗替尼敏感性中发挥关键作用。

背景意义：

口腔鳞状细胞癌(OSCC)是口腔最常见的恶性肿瘤,易发生局部复发和转移。目前，姑息性药物治疗是晚期、复发和转移性OSCC患者的重要治疗手段。然而，肿瘤的异质性和耐药性的存在已被证明限制了药物治疗的疗效。因此，需要阐明针对这些药物的敏感性和耐药性的潜在机制，以改善OSCC患者的反应。

m6A是mRNA中丰富的核苷酸修饰，但关于其在癌症药物敏感性和耐药性中作用的研究很少。此外，已有研究证明安罗替尼对OSCC具有抗肿瘤作用。但是迄今为止，安罗替尼在 OSCC 中的确切靶点和作用机制尚未得到充分阐明。

结果图形

（1）在OSCC治疗中，安罗替尼靶向 FGFR3 并抑制 FGFR3 磷酸化

图1：Anlotinib靶向FGFR3并抑制OSCC中的FGFR3磷酸化

(A-B) 通过qRT-PCR和Western blotting检测安罗替尼的酪氨酸激酶抑制剂 (TKI) 靶点

表1：在OSCC细胞系中，安罗替尼治疗靶点的 mRNA 相对表达量

（2）在OSCC中，FGFR3的表达水平影响安罗替尼的抗肿瘤活性

图2：FGFR3表达水平影响安罗替尼在口腔细胞癌中的抗肿瘤活性。

通过Western blotting检测 FGFR3 沉默效应

细胞增殖抑制试验显示安罗替尼对转染siFGFR3或rhFGF处理后的OSCC细胞(24小时)的细胞毒性的影响

细胞凋亡测定显示安罗替尼对转染siFGFR3或rhFGF处理后的OSCC细胞(24小时)的细胞凋亡比率的影响

Western blotting用于检测指定处理的OSCC细胞中FGFR3、AKT和mTOR的蛋白和磷酸化蛋白以及凋亡相关蛋白的表达水平

（3）METTL3调控FGFR3 mRNA m6A 修饰同时降低FGFR3 mRNA稳定性

图3：METTL3调节FGFR3 mRNA m6A修饰并抑制FGFR3 mRNA稳定性

在 METTL3 敲低的 OSCC 细胞(SCC9 和 SCC25)中，通过western blotting或 dot blot检测METTL3 蛋白水平和 RNA m6A水平

OSCC中的FGFR3的m6A修饰IGV图

MeRIP-qPCR 显示，在 SCC9 和 SCC25 细胞中 METTL3 敲低后， FGFR3 m6A的相对水平显著降低

western blotting显示，在 SCC9 和 SCC25 细胞中 METTL3 敲低后， FGFR3蛋白和 mRNA水平以及 p-FGFR3 蛋白水平显著增加

(E-F) 放线菌素d处理后，METTL3敲低的OSCC细胞中FGFR3 mRNA稳定性显著降低。环己胺检测，对照细胞和METTL3敲低的OSCC细胞之间的FGFR蛋白稳定性没有明显变化。用ImageJ来定量测定蛋白质的光密度。

（4）在OSCC 细胞中，METTL3与安罗替尼敏感性呈负相关

图4：METTL3 水平与口腔细胞中安罗替尼敏感性呈负相关

细胞活力测定安罗替尼对不同 OSCC 细胞系的细胞毒性

(B-C) 通过 qRT-PCR 和western blotting显示不同 OSCC 细胞系中 METTL3 的 mRNA 和蛋白质水平

(D) 细胞活力测定显示，与对照细胞(24 小时)相比，安罗替尼在 METTL3 敲低的 OSCC 细胞中的细胞毒性能力显著增加（IC50 降低）

(E) 细胞凋亡测定显示，在 SCC9 和 SCC25 细胞系中 METTL3 敲低后，经安罗替尼处理(24 小时)的细胞中细胞凋亡比例显著增加

表2：不同OSCC细胞中，IC50与METTL3表达的相关性分析

（5）METTL3 影响 PDX 模型中 FGFR3的表达和安罗替尼的抗肿瘤疗效

图5：METTL3影响PDX模型中安罗替尼的FGFR3表达和抗肿瘤疗效。

(A-D) PDX (人源肿瘤异种移植)模型中 METTL3、FGFR3 和 p-FGFR3 的代表性 H&E(组织病理学检查) 染色和 IHC 染色。#005代表最高的TGI率;#022 代表最低的 TGI 率

(E) METTL3的IHC评分与TGI(肿瘤生长抑制)率、FGFR3的IHC评分与TGI率、METTL3与FGFR3 的IHC评分、METTL3与p-FGFR3的IHC评分相关性

结论：

本研究利用MeRIP-seq技术及一系列实验，表明了FGFR3是安罗替尼的治疗靶点，并且METTL3介导的FGFR3 m6A修饰在OSCC(口腔鳞状细胞癌)的安罗替尼敏感性中发挥了关键作用。

关于易基因RNA m6A甲基化测序(MeRIP-seq)技术

易基因MeRIP-seq技术利用m6A特异性抗体富集发生m6A修饰的RNA片段（包括mRNA、lncRNA等rRNA去除所有RNA），结合高通量测序，可以对RNA上的m6A修饰进行定位与定量，总RNA起始量可降低至10μg，最低仅需1μg总RNA。广泛应用于组织发育、干细胞自我更新和分化、热休克或DNA损伤应答、癌症发生与发展、药物应答等研究领域；可应用于动物、植物、细胞及组织的m6A检测。

大样本量m6A-QTL性状关联分析，传统MeRIP单个样品价格高，通常难以承担。易基因开发建立MeRIP-seq2技术，显著提成IP平行性，实现不同样本间相对定量，降低检测成本。

易基因提供适用于不同科研需求的MeRIP技术：

m6A甲基化-常量mRNA 甲基化测序（MeRIP-seq）

m6A甲基化-常量mRNA +lncRNA甲基化测序（lnc-MeRIP-seq）

m6A甲基化-微量mRNA +lncRNA甲基化测序（Micro-lnc-MeRIP-seq）

高通量m6A甲基化-常量mRNA甲基化测序（MeRIP-seq2）

技术优势：

起始量低：样本起始量可降低至10-20μg，最低仅需1μg总RNA；

转录组范围内：可以同时检测mRNA和lncRNA；

样本要求：可用于动物、植物、细胞及组织的m6A检测；

重复性高：IP富集重复性高，最大化降低抗体富集偏差；

应用范围广：广泛应用于组织发育、干细胞自我更新和分化、热休克或DNA损伤应答、癌症的发生与发展、药物应答等研究领域。

研究方向：

m6A甲基化目前主要运用在分子机制的理论性研究

疾病发生发展：肿瘤、代谢疾病（如肥胖/糖尿病）、神经和精神疾病（如阿尔兹海默症/抑郁症）、炎症…

发育和分化：早期胚胎发育、个体/组织/器官生长发育、干细胞分化与命运决定、衰老

环境暴露与响应：污染、抗逆、生活方式

关于m6A甲基化研究思路

（1）整体把握m6A甲基化图谱特征：m6A peak数量变化、m6A修饰基因数量变化、单个基因m6A peak数量分析、m6A peak在基因元件上的分布、m6A peak的motif分析、m6A peak修饰基因的功能分析

（2）筛选具体差异m6A peak和基因：差异m6A peak鉴定、非时序数据的分析策略、时序数据的分析策略、差异m6A修饰基因的功能分析、差异m6A修饰基因的PPI分析、候选基因的m6A修饰可视化展示

（3）m6A甲基化组学&转录组学关联分析：Meta genes整体关联、DMG-DEG对应关联、m6A修饰目标基因的筛选策略

（4）进一步验证或后期试验

易基因科技提供全面的RNA甲基化研究整体解决方案，技术详情了解请致电易基因。

参考文献：

Chen J, Li S, Huang Z, Cao C, Wang A, He Q. METTL3 suppresses anlotinib sensitivity by regulating m6A modification of FGFR3 in oral squamous cell carcinoma. Cancer Cell Int. 2022 Sep 27;22(1):295.