一、概述
酵母可用于基础研究、酿造和蒸馏以及食品生产等多种应用，这些应用的全过程都离不开准确的细胞计数和活力测定。事实证明，较小的尺寸和形态对于自动细胞计数仪来说是相当具有挑战性的，利用活体染色剂手动计数酵母的方法繁琐且容易出错。在这篇文章中，我们分享了如何利用LUNA FX7自动细胞计数仪准确可靠地对酵母细胞进行计数。
二、实验方法
1）将酵母菌株EC1118接种到YPD肉汤中，30℃、200 rpm培养过夜
2）将酵母按照1：3至1：5的比例稀释在1XPBS中
3）稀释的培养物被稀释成2个相等的样品，然后将一份样品热灭活（65℃，20分钟）以生成“活细胞和死细胞”，用于活力测试
4）使用酵母细胞缓冲液Ⅱ按细胞：缓冲液=1：5和1：10的比例进一步稀释细胞
5） 活力测试：如表混合活细胞和死细胞
| 0% | 25% | 50% | 75% | 100% | |
| 活细胞 | 0 μl | 25 μl | 50μl | 75μl | 100μl |
| 死细胞 | 100μl | 75μl | 50μl | 25μl | 0μl |
三、实验结果
1、LUNA-FX7自动细胞计数仪计测的细胞活力线性情况
为了确定细胞活力的线性情况，使用活细胞和死细胞制备各种活力的样品，然后使用LUNA-FX7自动细胞计数仪进行计数。使用LUNA-FX7，可以在荧光模式下检查活力，也可以用明场模式的[CELL COUNTING & VIABILITY]检查。
为了在明场模式下测定细胞活力，将酵母样品与相同体积的0.02%亚甲蓝染色剂混合，并将10 μl样品加载到LUNA细胞计数载玻片上。酵母样品制备为死细胞(0%)、25%、50%、75%、活细胞(100%)。
使用LUNA-FX7 自动细胞计数仪明场模式的[CELL COUNTING & VIABILITY]测定细胞活力用亚甲蓝染色并标记的酵母细胞
如图所示，将5个样品用0.02%的亚甲蓝染色并在明场模式的[CELL COUNTING & VIABILITY]中进行图像观察与拍摄。重复计数3次，计算平均活力，并据此确认细胞活力的线性情况。在LUNA FX7明场模式[CELL COUNTING & VIABILITY]测得的活力R2=0.9964，与理论活力高度吻合。
使用LUNA-FX7 自动细胞计数仪明场模式的[CELL COUNTING & VIABILITY]测定细胞活力线性图证实了测量的活力与理论预期的活力(R2=0.9964)
紧接着，为了研究荧光模式下的细胞活力，将5个酵母样品用AO/PI 染色剂染色，并将10 μl样品加载到Photoslide载玻片中。在AO/PI染色后，拍摄并观察图像。
如下图所示，对5个不同活力的样品进行3次计数，测得的酵母细胞活力为R2=0.9979，与理论活力具有显著相关性。
使用LUNA-FX7 自动细胞计数仪荧光模式下的[CELL LINES & PRIMARY CELLS，ADVANCED]测定细胞活力用吖啶橙/碘化丙啶染色并标记的酵母细胞
使用LUNA-FX7 自动细胞计数仪荧光模式下的[CELL LINES & PRIMARY CELLS，ADVANCED]测定细胞活力线性图确认了测量的活力和理论上预期的活力(R2=0.9979)
2、 LUNA-FX7自动细胞计数仪细胞浓度分析的线性情况
为了确定使用LUNA-FX7 自动细胞计数仪计数酵母时不同浓度的线性，制备了高浓度酵母，并通过连续稀释来测量浓度。
为了在明场模式下观察，用0.02%亚甲蓝染色，并分别在明场模式下的[TOTAL CELL COUNTING]和[CELL COUNTING & VIABILITY]中进行计数。
从图中可以看出，测得的R2值分别为0.998和0.9991。在荧光模式下也同样观察到这一点，当用AO/PI染色并在[ADVANCED]模式下捕获时，R2值为0.9753。这意味着使用LUNA-FX7进行的酵母计数显示出从高浓度到低浓度的高线性度，且使用LUNA-FX7可以进行更准确的测定。
在LUNA-FX7 自动细胞计数仪的明场模式下测量酵母样品的浓度
总细胞计数
细胞计数和活力
在LUNA-FX7自动细胞计数仪荧光模式的[CELL LINES & PRIMARY CELLS, ADVANCED]中测量酵母样品的浓度
3、LUNA-FX7自动细胞计数仪与血细胞计数器的比较
我们进行了一项实验来比较传统使用的血细胞计数器(Hemocytometer)和LUNA-FX7。
与之前的实验一样，样品用0.02%亚甲蓝和AO/PI染色，并各10 µl装载到血细胞计数器、LUNA细胞计数载玻片和 PhotonSlide载玻片上。在LUNA-FX7的明场和荧光模式两种模式下拍摄图像，并将浓度与血细胞计数器上测量的浓度进行比较。如图所示，血细胞计数器测量的值与LUNA-FX7测量的值没有观察到显著差异。
血细胞计数器和LUNA-FX自动细胞计数仪的酵母计数结果比较
结论
在此实验中，我们证明了LUNA-FX7可以准确可靠地对酵母细胞进行计数。此外，与传统的手动计数方法相比，使用LUNA-FX7计数酵母的速度快20倍、更可靠且不易出错。
四、点成生物细胞计数解决方案
点成Aligned genetics为用户提供了先进的自动细胞计数仪设备，设备具有极高的精确度和可重复度，单次最多可检验8个样品，细胞计数浓度范围广，内置QC软件提供值得信任的数据，还符合21 CFR PART 11法规。
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