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DNA甲基化是骨骼肌发育中关键的表观遗传调控机制。但胚胎鸭骨骼肌发育中负责DNA甲基化的调控因子仍然未知。

2023年10月23日，南京农业大学动物科技学院于敏莉副教授团队在《Int J Mol Sci》杂志发表题为“The Integration of Genome-Wide DNA Methylation and Transcriptomics Identifies the Potential Genes That Regulate the Development of Skeletal Muscles in Ducks”的研究论文，该研究旨在研究鸭骨骼肌DNA甲基化的调控作用，采用WGBS和RNA-seq方法揭示了鸭骨骼肌DNA甲基化组和转录组图谱，通过DNA甲基化与基因表达的综合关联分析，筛选出与DNA甲基化相关的关键基因和信号通路，为探索DNA甲基化和鸭骨骼肌发育的潜在调控机制提供有价值的信息。

标题：The Integration of Genome-Wide DNA Methylation and Transcriptomics Identifies the Potential Genes That Regulate the Development of Skeletal Muscles in Ducks（全基因组DNA甲基化和转录组学的整合确定了调节鸭骨骼肌发育的潜在基因）

时间：2023-10-23

期刊：International Journal of Molecular Sciences

影响因子：5.6

技术平台：WGBS、RNA-seq等

研究摘要：

DNA甲基化是骨骼肌发育过程中重要的表观遗传调控机制。然而，在胚胎鸭骨骼肌发育过程中负责DNA甲基化的调控因子仍不清楚。本研究对胚胎第21天(E21)和第28天(E28)的骨骼肌进行了全基因组重亚硫酸盐测序(WGBS)和转录组测序（RNA-seq）。结果表明DNA甲基化模式主要位于胞嘧啶-鸟嘌呤(CG)区域，内含子、外显子和启动子区域的甲基化水平较高。研究共鉴定出7902个差异甲基化区域(DMRs)，对应3174个差异甲基化基因(DMG)。通过对WGBS和转录组学的综合分析，鉴定出1072个与差异表达基因(DEGs)负相关的DMG基因。GO分析显示磷酸化、激酶活性、磷酸转移酶活性、醇基受体以及与细胞骨架蛋白的结合显著富集。KEGG分析显示MAPK信号、Wnt信号、apelin信号、胰岛素信号和FoxO信号显著富集。富集基因筛选显示，高甲基化抑制Idh3a、Got1、Bcl2、Mylk2、Klf2、Erbin、Klhl38表达，低甲基化促进Col22a1、Dnmt3b、Fn1、E2f1、Rprm、Wfikkn1表达。进一步预测表明，Klhl38、Klf2、Erbin、Mylk2和Got1启动子中的CpG岛可能在调控骨骼肌发育中发挥重要作用。本研究为鸭骨骼肌发育的表观遗传调控提供了新的见解。

研究结果：

1. 鸭骨骼肌中的DNA甲基化模式

图1：胚胎鸭DNA甲基化表征

1. 实验设计。
2. 鸭胚胎骨骼肌发育过程中不同甲基化类型的平均比例。甲基化mCG、mCHG和mCHH分别用蓝色、橙色和灰色表示。
3. 不同甲基化类型甲基化水平总体分布的小提琴图。右坐标代表不同的序列环境，包括CG、CHG和CHH, H = A、C或t；左坐标代表甲基化水平，横坐标代表10 kb为一个bin的不同样本。
4. 不同甲基化类型甲基化密度总体分布的小提琴图。右边的坐标代表不同的序列环境。左侧纵坐标表示甲基化水平，横坐标表示以10kb为一个bin的不同样本。
5. 不同基因组元件的甲基化水平分布。横坐标为基因组元素，纵坐标为甲基化水平。对所有基因功能区的C位点水平进行平均，并以不同颜色区分不同背景。
6. 上游/下游2K区域甲基化水平的分布。横坐标显示不同区域，纵坐标表示甲基化水平。不同环境被赋予不同的颜色。

（2）差异甲基化区域 （DMR） 的鉴定

图2：胚胎鸭不同甲基化区域(DMRs)和不同甲基化基因(DMG)的鉴定。

1. DMRs的维恩图。
2. CG背景下DMRs的长度分布。DMR长度在横坐标上表示；每个长度处的密度在纵坐标上表示，拟合曲线分布用黑色表示。
3. 甲基化水平分布小提琴图。显示DMR甲基化水平在CG背景下分布。横轴表示比较组合组，纵坐标表示甲基化水平值。
4. CG背景下的DMR锚定区。横坐标表示每个区域DMR类型，纵坐标表示每个区域高/低DMR数量。

（3）甲基化基因的功能富集

图3：DMG的功能富集分析。

1. CG背景下富集基因GO分析条形图。富集GO相关基因分类统计：y轴为富集GO项，x轴为DMR相关基因数量。生物过程和分子功能用不同的颜色来区分。
2. CG背景下富集的KEGG代谢通路散点图。通路名称表示在纵轴上，富集因子表示在横轴上。每个通路中DMR相关基因的数量由点的大小表示，点的颜色对应不同的q值。

（4）DNA甲基化与基因表达的关联分析

图4：DNA甲基化与基因表达的关联分析。

1. DMG与DEGs比较分析维恩图。CG、CHG和CHH不同序列环境下的DMG。
2. CG环境下DMG和DEGs比较分析韦恩图。Hyper代表锚定在高甲基化区域基因，hypo代表锚定在低甲基化区域的基因；up为高表达基因，down为低表达基因。

（5）富集与DEG负相关DMG的关键通路

图5：DMGs和DEGs负相关基因的功能富集分析。

1. 交叉基因富集的GO条形图。富集GO相关基因分类：富集GO项表示在纵坐标上，DMR相关基因的数量显示在横坐标上。使用不同颜色来区分生物过程、细胞成分和分子功能。
2. 交叉基因富集的KEGGs信号通路散点图。通路名称显示在纵轴上，富集因子显示在横轴上。每个通路中DMR相关基因的数量由点大小表示，并且点的颜色对应于不同q值。

表1：从全基因组DNA甲基化和转录组关联分析中选择的基因

（6）骨骼肌发育相关基因的鉴定

图6：关键基因的定量验证。通过RT-qPCR检测候选基因在骨骼肌不同发育阶段的相对表达。

A-B. DEGs在PM中上调和(B)下调。

C-D. DEGs在LM中上调和(D)下调。

Β-actin作为内部参照。数值表示为3次重复的平均值±SEM;* p < 0.05， ** p < 0.01。

（7）启动子CpG岛预测

图7：启动子CpG岛预测。Erbin (A)、Klf2 (B)、Got1 (C)、Klhl38 (D)和Mylk2 €启动子区域的CpG岛。

研究小结：

通过整合全基因组DNA甲基化和转录组分析，系统地鉴定了参与胚胎鸭骨骼肌发育的DMRs，共鉴定出13个可能与鸭骨骼肌发育相关的基因。富集基因的筛选表明，高甲基化抑制Idh3a、Got1、Bcl2、Mylk2、Klf2、Erbin和Klhl38表达，低甲基化促进Col22a1、Dnmt3b、Fn1、E2f1、Rprm和Wfikkn1表达。预测了Erbin、Klf2、Got1、Klhl38和Mylk2五个关键基因启动子区的CpG岛。对启动子区DNA甲基化与基因表达之间的复杂关系有了新的见解。本文还假设DMRs促进表达水平变化，从而影响了随后的转录和翻译。这些结果为进一步研究调控鸭骨骼肌发育的表观遗传学机制提供了有价值的信息。

关于易基因全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）

全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS）可以在全基因组范围内精确的检测所有单个胞嘧啶碱基（C碱基）的甲基化水平，是DNA甲基化研究的金标准。WGBS能为基因组DNA甲基化时空特异性修饰的研究提供重要技术支持，能广泛应用在个体发育、衰老和疾病等生命过程的机制研究中，也是各物种甲基化图谱研究的首选方法。

易基因全基因组甲基化测序技术通过T4-DNA连接酶，在超声波打断基因组DNA片段的两端连接接头序列，连接产物通过重亚硫酸盐处理将未甲基化修饰的胞嘧啶C转变为尿嘧啶U，进而通过接头序列介导的 PCR 技术将尿嘧啶U转变为胸腺嘧啶T。

应用方向：

WGBS广泛用于各种物种，要求全基因组扫描（不错过关键位点）

• 全基因组甲基化图谱课题
• 标志物筛选课题
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参考文献：

Lu Y, Zhou J, Li F, Cao H, Zhang X, Yu D, He Z, Ji H, Lv K, Wu G, Yu M. The Integration of Genome-Wide DNA Methylation and Transcriptomics Identifies the Potential Genes That Regulate the Development of Skeletal Muscles in Ducks. Int J Mol Sci. 2023 Oct 23;24(20) pii: ijms242015476.

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