5+氧化应激+预后模型

今天给同学们分享一篇氧化应激+预后模型的生信文章“A four oxidative stress gene prognostic model and integrated immunity-analysis in pancreatic adenocarcinoma”，这篇文章于2023年1月13日发表在Front Oncol期刊上，影响因子为5.738。

胰腺腺癌（PAAD）具有高度侵袭性和预后不良的特点。氧化应激对肿瘤的发生和发展有很大影响。然而，氧化应激相关基因对 PAAD 患者预后的预测作用仍不明确。本研究旨在构建一个基于氧化应激基因的 PAAD 预后模型，并评估其预测价值。

1. DEOSGs 鉴定

为了筛选与氧化应激相关的基因，作者按照流程图（图1）进行了研究。在 TCGA 数据库（训练集）中，共有 2994 个基因被鉴定为 mRNA 水平的 DEGs（图 2A）。在 GSE28735、GSE62165 和 GSE62452 中，分别有 4603、7291 和 4428 个基因被鉴定为 DEGs（图 2B-D）。在上述鉴定出的 DEGs 中，有 356 个 DEGs 是四个数据集共有的（图 2E），其中 55 个基因与氧化应激有关，被鉴定为 DEOSGs（图 2F）。考虑到基因表达水平（每百万映射读数中每千碱基转录本片段的平均值（FPKM）> 1），55 个 DEOSGs 中的 52 个被选中进行进一步分析。

图1 研究流程图

图2 识别不同表达的 OS 基因

2. 预后模型的构建与评估

为了构建预后模型，进一步应用52个DEOSGs分析它们与PAAD患者预后的关系。首先，通过单变量考克斯回归分析，确定了22个P<0.05的基因为PAAD预后相关基因，并在森林图中列出了前10个预后相关的DEOSGs（图3A）。然后，通过 Kaplan-Meier 分析选出了与总生存期明显相关的 12 个基因（图 3B），并对其中 P < 0.1 的 4 个基因（MET、CDK1、CTTN、FYN）进行了多变量 Cox 回归分析（图 3C）。最后，应用上述四个基因构建预后模型

图3 为 PAAD 患者构建预后模型和提名图

为了提高临床应用性，作者联合应用风险评分和患者信息建立了一个预测模型。在年龄、性别和临床分期这三个具有完整临床信息的参数中，临床分期与患者的预后有显著相关性，而患者的预后与性别和年龄没有显著相关性（图 3D）。结合上述四个基因的表达水平和 PAAD 患者的临床分期信息，构建了一个可以预测 PAAD 患者 1 年和 2 年 OS 概率的提名图（图 3E）。

此外，作者还分析了风险评分与患者生存时间、生存状态或上述四种基因表达水平之间的关系。如图 4A 所示，随着风险评分的增加，患者的整体生存概率明显下降。不出所料，风险因子 MET 和 CDK1、CTTN 的表达随着风险评分的增加呈上升趋势；相反，保护因子 FYN 的表达随着风险评分的增加呈下降趋势（图 4A）。最后，作者用对数秩检验评估了高风险组和低风险组的生存概率，结果显示预后差异显著（P = 1.5 x 10 -5 ）（图 4B）。此外，时间 ROC 分析表明预测模型是可信的，训练集 1 年和 2 年 OS 的曲线下面积（AUC）分别为 0.87 和 0.91，验证集分别为 0.74 和 0.81（图 4C 和 D）。这些数据表明，由这四个氧化应激基因构建的预后模型对 PAAD 患者的预后具有良好的预测能力。

图4 对训练集 PAAD 患者总生存期预后模型的评估和验证

3. 对训练集 PAAD 患者总生存期预后模型的评估和验证

为了探究参与PAAD高危或低危患者不同预后的潜在信号通路，作者进行了GSEA分析。结果显示，与高风险患者相比，低风险患者有几条通路明显富集，其中包括 B 细胞活化（NES=-1.62，P < 0.001）、B 细胞增殖（NES=-1.73，P < 0.001）、白细胞介导的免疫（NES=-1.52，P < 0.001）、白细胞增殖（NES=-1.44，P < 0.001）、T 细胞活化（NES=-1.36，P < 0.001）、T 细胞受体复合物（NES=-1.82，P < 0.001）、趋化因子信号通路（NES=-1.63，P＜0.001）、免疫受体活性（NES=-1.62，P＜0.001）和趋化因子信号通路（NES=-1.63，P＜0.001）（图 5A）。此外，谷氨酸受体信号通路（NES=-1.90，P＜0.001）、胰岛素分泌（NES=-1.77，P＜0.001）以及甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢（NES=-1.67，P＜0.001）这3条与细胞代谢相关的通路也在低风险患者中显著富集（图5B）。相反，DNA修复（NES=1.52，P＜0.001）、重组修复（NES=1.41，P＜0.0019）和细胞周期（NES=-2.01，P＜0.001）等3条重要通路在高危患者中明显富集（图5C）。在PADD基因突变方面，高危组和低危组的突变总数分别为10717和864（图5D）。高风险组突变频率最高的前 10 个基因是 TP53、KRAS、CDKN2A、SMAD4、RNF43、TTN、MUC1、ADAMTS12、FLG 和 KMT2D，而低风险组突变频率最高的前 10 个基因是 TP53、KRAS、CDKN2A、SMAD4、RNF43、TTN、TGFBR2、SYNE1、PKHD1 和 FLRT2（图 5E）。至于两组共有的六个基因（TP53、KRAS、CDKN2A、SMAD4、RNF43、TTN），高风险组的突变频率也高于低风险组（图 5F）。这些结果表明，免疫相关通路和代谢通路在低风险组明显富集，而 DNA 修复通路在高风险组明显富集。

图5 PAAD 高危和低危患者的功能 GSEA 和基因突变分析

由于大部分富集的通路与免疫系统有关，作者转而对高风险组和低风险组进行免疫浸润分析。如图 6A 所示，在 28 个免疫细胞中，有 23 个细胞在高风险组和低风险组之间发生了显著变化。在这 23 个免疫细胞中，19 个细胞（活化的 B 细胞、活化的 CD8 + T 细胞、活化的树突状细胞、中心记忆 CD4 + T 细胞、效应记忆 CD4 + T 细胞、效应记忆 CD8 + T 细胞、嗜酸性粒细胞、未成熟的 B 细胞、未成熟的树突状细胞、巨噬细胞、肥大细胞、MDSC 细胞）发生了明显变化、巨噬细胞、肥大细胞、MDSC、单核细胞、自然杀伤 T 细胞、自然杀伤细胞、浆细胞状树突状细胞、调节性 T 细胞、T 滤泡辅助细胞和 1 型 T 辅助细胞）与风险评分呈显著负相关。相反，包括 CD56dim 自然杀伤细胞、中性粒细胞、17 型 T 辅助细胞和 2 型 T 辅助细胞在内的 4 种细胞与风险评分呈显著正相关（P < 0.05）。由于23种明显改变的免疫细胞中有10种与T细胞有关，作者推测这4种氧化应激相关基因预后模型与T细胞免疫有密切关系。考虑到最近基于检查点的免疫疗法取得了突破性进展，作者对高风险组和低风险组的 25 个免疫检查点基因进行了差异表达分析。结果显示，CD47、TNFSF9 和 PVR 与风险评分呈正相关；而 HLA-DQB1、CD96、SIRPA、CD48、HLA-DRB1、BTN2A2、HLA-DOA、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DMB、HLA-DMA、BTNL9、HLA-DRA、CD27 和 HLA-DOB 则呈相反趋势（图 6B）。

图6 免疫浸润和免疫相关基因分析

从 GSEA 和免疫浸润分析中，作者注意到高风险组和低风险组的 T 细胞活化存在显著差异。因此，作者对高风险组和低风险组之间的 29 个 T 细胞增殖基因进行了差异表达分析。对合成的 T 细胞增殖驱动基因的分析表明，LTBR、IL1RN、BATF、AHNAK、SLC10A7、CLIC1、RAN、CDK2、CDK1 和 AHCY 与风险评分呈正相关；而 CXCL12、NFYB、FOSB、CYP27A1、GPD1 和 ITM2A 则呈相反趋势（图 6C）。综上所述，作者的数据揭示了氧化应激可能通过激活CD4 + T和CD8 + T细胞重塑肿瘤免疫环境，从而影响PAAD患者的预后。

利用 ICIs 进行免疫治疗给 PAAD 患者带来了巨大的希望，因此作者通过 TIDE 算法分析了 ICI 治疗的耐药性。如图 6D 所示，高危组中的 TIDE 评分、排除评分和功能障碍评分均显著增加，这表明高危患者的免疫逃逸潜能增加，因此 ICI 的疗效可能较差。

4. 四种预后 DEOSGs 的表达验证

为了验证四种预后DEOSGs在PAAD中的表达水平，作者首先通过CPTAC数据库和免疫组化（IHC）染色检测了它们的蛋白水平。作者发现，与正常组织相比，PAAD 中四种预后 DEOSGs 的蛋白水平均明显升高（图 7A）。同时，IHC 染色结果进一步验证了这四个基因在 PAAD 患者中的高表达（图 7B、C）。此外，与蛋白水平一致，与邻近癌旁组织相比，MET、CDK1、CTTN 和 FYN 的 mRNA 水平在 PAAD 中也显著上调（图 7D）。综上所述，作者的研究结果表明，PAAD中四种预后性DEOSGs的表达均呈上调趋势，这表明PAAD中四种预后性DEOSGs的联合高表达可能与患者的不良预后有关。