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该研究应用多组学分析（代谢组学分析+微生物组学分析）分析了人类ESRD肠道微生物组组成、尿毒症毒素和肾衰竭之间的关系，使用独立队列和无菌动物模型对多组学结果及研究提出的ESRD机制假设进行验证，首次从肠道微生物的角度上系统的阐述了尿毒症毒素驱动肾衰竭的机制，展现了菌群失调与临床表型关系，并鉴定了一些与血液尿毒症毒素累积相关的关键细菌，为通过肠道菌群调控毒素的产生提供了有效的靶点，并为ESRD的辅助治疗提供了新的思路和理论支持。
doi:
10.1136/gutjnl-2019-319766
链接：
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7677483/#SP2
前言摘要
● 背景
● 终末期肾病(ESRD)作为慢性肾脏疾病(CKD)的晚期并发症，是世界范围内发病率和死亡率的主要原因之一。目前治疗费用惊人，ESRD患者的肠道屏障处于受损状态[1]，早期症状并不明显，随着肾脏功能的不断下降，血液及其他代谢区中毒性代谢物的积累逐渐增加，往往在后期会出现恶心、呕吐、贫血等尿毒症症状，患者需要通过血液透析及肾脏移植维持生命，而尿毒症毒素中有很大一部分来自肠道微生物群[2]，很多大分子毒素无法通过透析有效地去除[3-4]。
● 2016年发表在Cell Host Microbe上的一项研究揭示[5]，特定肠道微生物的调节被证明可以调节循环尿毒素硫酸吲哚的浓度，主要的途径为（大肠）色氨酸+细菌色氨酸酶-吲哚➡（门静脉）➡（肝）P450酶+磺基转移酶-**硫酸吲哚酚(IS)**➡（肾）促进慢性肾病发展。研究指出，通过靶向微生物群来控制宿主 IS 水平一次来延缓慢性肾病的发展是可能的。
●而该研究则以肾衰竭为疾病背景，基于已有的研究，进一步探讨了异常的肠道微生物对ESRD患者疾病的发展带来的作用，有助于建立异常肠道微生物群与人类肾脏疾病进展之间的因果关系。
● 结论
● ESRD患者的粪便代谢组与血清代谢组密切相关，其特征是多种尿毒症毒素和次级胆汁酸(SBA)的积累。
● 肠道微生物群似乎是宿主粪便和血清代谢景观的重要决定因素，ESRD患者尿毒症毒素和SBA的富集与肠道微生物群介导的芳香族氨基酸降解和微生物SBA生物合成有关。
● 方法
●研究首先对ESRD患者及健康人的血清代谢组及粪便代谢组进行了对比分析，通过宏基因组测序获得ESRD患者及健康人肠道菌群物种组成及功能特征，再应用随机森林预测模型预测ESRD尿毒症毒素累积的关键细菌，以及无菌动物模型验证肠菌改变与尿毒症毒素累积与肾脏纤维化之间的关系。****
● 意义
● 本研究表明,终末期肾病患者肠道微生物群的异常可能导致疾病的严重程度,提示调节肠道微生物群作为一种可行的透析补充治疗方式应当被探索。**
结果
● 1 与ESRD患者相关的明显血清和粪便菌群特征
● ESRD组和对照组血清代谢组明显不同且与原发病无关，ESRD血清代谢组的主要特征是9种尿毒症毒素的富集和胆汁酸组成的不平衡，ESRD状态（ 解释了近11%的血清代谢组差异）和性别、体重和总血胆固醇C等其他生物临床变量（共同解释了额外的8.5%的差异）是血清代谢组差异的主要原因；
●ESRD组和对照组的粪便代谢组明显不同，ESRD阶段再次成为患者组和对照组粪便代谢组差异的主要原因（它解释了4.2%的差异，而临床指标、药物等等其他生物临床变量仅解释了5.8%），糖尿病状态也是引起差异的一个重要因素。
● 普氏分析结果 显示血清和粪便代谢谱具有很强的协同性，且血清尿毒症毒素与其粪便前体密切相关，表明ESRD患者肠道的代谢变化对血清中尿毒症毒素的积累起推动作用。
●**结论：**ESRD患者和健康个体血清代谢组不同，ESRD患者的粪便代谢组发生改变并与血清代谢组显著相关。
● 2 ESRD患者肠道微生物组的分类和功能特征
● 利用测序数据收集了1140万个非冗余基因的基因目录，代表了这个队列群体的微生物群，这些基因被注释到11867个KEGG功能分类中并被组织成900个亚基因组物种（MGS），其中约66%可以被分配到已知的属中。利用基因图谱发现ESRD患者微生物群的微生物多样性、分类组成和功能潜力与健康人有显著差异。
● 分析发现ESRD状态可以明显影响微生物群，ESRD患者粪便中SCFAs减少可能是产生SCFA的微生物减少导致的，ESRD患者肠道微生物具有鲜明特征，且与ESRD患者血清与粪便代谢产物改变之间存在明显相关性。
●结论：**ESRD患者尿毒症毒素的富集与肠道微生物群介导的芳香族氨基酸降解和微生物SBA生物合成有关。
● 3 ESRD患者肠道菌群影响宿主血清和粪便代谢
● 为验证肠道菌群是否介导了ESRD患者的代谢组学变化，对肠道亚基因组物种（MGS）、血清和粪便代谢物的丰度进行了组间相关分析以进一步探讨肠道微生物群与代谢组之间的关系。发现尿毒症毒素和胆汁酸占ESRD患者血清代谢物相关性的95.0%，明显高于健康对照组。ESRD患者的血清尿毒症毒素和胆汁酸受到肠道菌群和粪便代谢组的显著影响。肠道菌群对ESRD患者代谢谱的影响相当大，分别占血清和粪便代谢组变化的31.3%和39.0%，类似的效应大小(血清代谢组变化的20%-40%)在3项独立研究（肥胖个体、心血管疾病患者或糖尿病患者）中同样存在，在ESRD患者(分别占血清和粪便代谢组变异的15.4%和12.5%)和健康对照组(分别占血清和粪便代谢组变异的12.6%和14.4%)中，宿主表型对代谢组的影响明显小于肠道微生物组对代谢组的影响。
● **结论：**除肾脏功能外的肠道微生物似乎是宿主粪便和血清代谢变化的重要决定因素。
● 4 ESRD患者肠道菌群组成的改变能够促进尿毒症毒素产生和SBA生物合成
●研究还预测了编码这些化合物主要合成途径中关键酶的微生物基因以进一步证实肠道微生物在生产尿毒症毒素和SBAs中的潜在作用。在基因目录中鉴定了编码6种主要尿毒症毒素和SBAs关键合成酶的5134个基因，这些基因在ESRD患者和富含ESRD的微生物物种中明显更丰富，粪便中的代谢物浓度与同源合成酶编码基因的丰度呈正相关。应用随机森林模型确定每种毒素或SBA与含有毒素/SBA合成酶编码基因的物种丰度之间的相关性，最大化毒素强度和血清/粪便中SBAs浓度的随机森林预测模型确定了约83种物种，这些模型解释了血清/粪便中目标代谢物浓度变化的26%，表明相应的物种在很大程度上促进了毒素和SBA的产生，大多数物种(59%)在患者组比对照组更丰富
● **结论：**参与尿毒症毒素和SBA产生的微生物可作为ESRD的诊断标志物。
● 5肠道菌群的调节能够影响啮齿动物毒素积累和肾脏疾病严重程度
● CKD小鼠：
● 将来自ESRD患者或健康受试者的新鲜肠道菌群移植到腺嘌呤诱导的CKD小鼠身上以检验肠道菌群至少在一定程度上通过尿毒症毒素促进肾功能衰竭发展的假设。受体小鼠在移植后有效地重新获得了患者组或健康组供者肠道菌群的分类特征。与接受来自健康捐赠者肠道菌群的受体小鼠相比，接受ESRD肠道菌群的小鼠表现出更严重的肾脏纤维化、肾小球硬化和氧化应激，血清尿素和肌酐水平增加，血清中几种尿毒症毒素(硫酸对甲酚、苯乙酰甘氨酸、苯硫酸盐和硫酸吲哚酚)的水平显著升高；
● CKD大鼠：
● 1、在5/6肾切除CKD大鼠模型中，灌胃给予迟缓埃格特菌和具核梭杆菌。与假喂养的大鼠相比尿毒症大鼠血清尿毒症毒素水平显著升高，同时伴有严重的氧化应激、肾小球硬化、肾纤维化以及血清肌酐和/或尿素水平的升高。
● 2、CKD大鼠灌胃动物双歧杆菌A6(一种促进健康的益生菌)后发现，即使微生物群的总体组成没有明显改变，两个毒素驱动物种迟缓埃格特菌和具核梭杆菌的丰度也显著下降。同时血清尿毒症毒素、肌酐和尿素浓度显著降低，肾脏纤维化和肾小球硬化减轻。
● 结论：
● 1、ESRD患者肠道菌群失调会通过影响尿毒症毒毒素加重肾脏疾病发展。
● 2、细菌可通过产生尿毒症毒素加重肾脏疾病。
● 3、益生菌可以通过调节毒素驱动的种类来延缓CKD模型大鼠肾脏疾病的发展
6.肠道微生物群改变加重 ESRD的机制
●图中，富含 ESRD 和耗尽ESRD 的微生物种类、功能和粪便/血清代谢物分别用红色和蓝色标记。Eggerthella lenta，Fusobacterium ucleatum和 Alistipes shahii等物种的富集导致肠道中 AAA 降解，SBA和 TMAO 生物合成增加，导致 ESRD 患者粪便和血液中尿毒素和 SBA 水平升高。同时Faecalibacterium prausnitzii, *Roseburia *，Prevotella等物种的枯竭导致肠道微生物 SCFA 生物合成减少。
● 结论：肠道微生物群驱动的不良代谢可能加重CKD 进展，诱发并发症和全身炎症，并增加终末期肾病患者的死亡率。
思考
●大阵列临床样本：样本量相对较大，纳入了来自北京4所血液透析中心的223名ESRD患者和69名健康对照，验证队列包括12例ESRD患者和12例性别和年龄匹配的健康对照。
● 数据整合分析：整合了基于临床及问卷调查获得的血清粪便代谢组、肠道微生物组以及宿主表型的多维数据集进行分析。
● 模型预测：应用随机森林预测模型预测ESRD尿毒症毒素累积的关键细菌，为通过肠道菌群调控毒素的产生提供了有效的靶点。
● 动物实验：无菌小鼠-粪菌移植；抗生素处理大鼠-单菌株（E. lenta and F. nucleatum）灌胃实验+益生菌（*Bifidobacterium animalis *A6）灌胃，验证了ESRD患者肠道菌群失调会通过影响尿毒症毒毒素加重肾脏疾病发展，且使用益生菌可以通过调节毒素驱动的种类来延缓CKD模型大鼠肾脏疾病的发展。
● HPLC、GC-MS对血清和粪便代谢物进行定量;宏基因组测序获取ESRD 肠菌群物种组成及功能特征；16S rRNA测序对比分析小鼠粪菌移植后与供体的肠微类群组成的差异。
参考文献
[1] Vaziri ND, Zhao YY, Pahl MV. Altered intestinal microbial flora and impaired epithelial barrier structure and function in CKD: the nature, mechanisms, consequences and potential treatment. Nephrol Dial Transplant. 2016 May;31(5):737-46. doi: 10.1093/ndt/gfv095. Epub 2015 Apr 16. PMID: 25883197.
[2] Tanaka H, Sirich TL, Meyer TW. Uremic Solutes Produced by Colon Microbes. Blood Purif. 2015;40(4):306-11. doi: 10.1159/000441578. Epub 2015 Nov 17. PMID: 26656941.
[3] Meyer TW, Hostetter TH. Uremia. N Engl J Med. 2007 Sep 27;357(13):1316-25. doi: 10.1056/NEJMra071313. PMID: 17898101.
[4] Depner TA. Uremic toxicity: urea and beyond. Semin Dial. 2001 Jul-Aug;14(4):246-51. doi: 10.1046/j.1525-139x.2001.00072.x. PMID: 11489197.
[5] Devlin AS, Marcobal A, Dodd D, Nayfach S, Plummer N, Meyer T, Pollard KS, Sonnenburg JL, Fischbach MA. Modulation of a Circulating Uremic Solute via Rational Genetic Manipulation of the Gut Microbiota. Cell Host Microbe. 2016 Dec 14;20(6):709-715. doi: 10.1016/j.chom.2016.10.021. Epub 2016 Dec 1. PMID: 27916477; PMCID: PMC5159218.
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