细胞代谢调控正常细胞功能以及多种疾病状态的病理生理。最近，免疫细胞代谢研究（immunometabolism）成为一个研究热点，揭示了包括抗病毒免疫、自身免疫和抗肿瘤反应在内的炎症代谢调节。然而，由于代谢网络的规模和复杂性，某个代谢的扰动（perturbation）能够产生级联效应(cascade effects)并改变代谢网络中看似较远的部分或者让经典通路“弯道超车”。因此，需要在系统水平上观测特定反应/酶，以理解代谢及其在疾病中的异常调控。在CELL文章《Metabolic modeling of single Th17 cells reveals regulators of autoimmunity》中作者提出了一种基于单细胞RNA测序和流平衡分析（flux balance analysis）描述细胞代谢状态的算法 – compass（GitHub - YosefLab/Compass: In-Silico Modeling of Metabolic Heterogeneity using Single-Cell Transcriptomes）。

流平衡分析（flux balance analysis）将代谢网络拓扑学和化学计量学知识翻译成数学对象，并用在代谢流预测上。提供了一种非常有用的场景：根据单细胞基因表达谱或者传统RNA-seq基因表达谱研究细胞的代谢异质性。

                                                     图1. COMPASS算法

如图1所示，使用单细胞转录组（Th17p细胞和Th17n细胞）和代谢模型作为COMPASS的输入，经过流平衡分析，找到了两群细胞间异常的代谢通路（图2）及相关的反应/酶，并进行了分子和功能验证，以及小鼠体内验证。

                                                            图2.4个差异通路

如图2所示：左上：糖酵解通路（Glycolysis）在Th17p细胞中更加活跃（反应/酶几乎都分布在虚线右侧）；右上：三羧酸循环（TCA cycle）中大部分反应/酶在Th17p细胞中更活跃。左下：脂肪酸氧化的3个酶在Th17n细胞中更活跃；右下：氨基酸代谢中，丝氨酸羟甲基化转移酶在Th17p细胞中更活跃，而精氨酸脱羧酶在Th17n细胞中更活跃。

看到这里，大家应该对文章有了基本的理解。细胞代谢网络太复杂，难以研究，然而我们手上不是有现成的一堆单细胞/bulk RNA-seq的表达数据么，我们可以通过大量样品和严格的假设检验以酶的mRNA表达为桥梁来研究细胞代谢，将基因表达-代谢反应/酶活性-细胞代谢状态联系起来。例如我们知道了某反应在癌细胞中活跃，就可以通过抑制剂阻断（或者平衡）这个反应，改变免疫细胞的代谢状态，从而达到治疗癌症的目的。

1.安装

Compass是用python编写的，需要python 3环境，numpy，scipy，matplotlib等包。

由于计算量太大，还需要一个IBM CPLEX Optimization Studio优化器（学术用户可以注册下载，注意版本）

conda 个python3环境

pip install numpy, scipy, matplotlib

下载IBM CPLEX Optimization Studio(需要学术版)

./xxx.bin 装到software目录（自己指定），一路enter或者yes

cd /home/software/CPLEX_Studio129/cplex/python/3.6/x86-64_linux

python setup.py install

python -m pip install git+https://github.com/yoseflab/Compass.git --upgrade

compass -h 测试安装是否成功

2.运行

输入：表达矩阵（tpm，cpm等，一个基因一行，一个样品一列），单细胞的话配上genes和sample文件。运行速度很慢，可以多线程加速

                                                     图3. Expression.csv输入

compass --data expression.csv --num-processes 10 --species homo_sapiens （常规转录组）

compass --data-mtx expression.mtx genes.tsv sample_names.tsv --num-processes 10 --lambda 0.25 --species homo_sapiens  （单细胞）

3.结果

运行完上面的命令后，会在当前目录生成reaction.csv文件(图4)。其中的值是反应罚分（reaction penalties），高得分表示该反应的可能性较低。

图4. reaction.csv输出

4. 后处理

步骤3获得的是每个反应在每个样品中的反应罚分，我们需要根据Recon2 meta信息（图5）将A列的反应编码转成人们可读的代谢通路名字，将反应罚分进行转化（转成数值大的表示反应活性高，加1，取-log）,然后使用wilcoxon或者Cohen’d进行差异分析。

                                                       图5. 后处理需要的3个文件

                                图6. 最终结果表格，根据这个表格寻找更兴趣的反应/代谢，绘图

各列说明：

A：reaction编码， “_pos” 表示化学反应往右侧，“_neg”表示反应向左侧

B/C/E：wilcoxon统计结果

D：cohens_d： cohen’s d用于计算两组均值差异的效应量， d = 0.2(效果小) ; d = 0.5(效果中) ; d = 0.8(效果大)。供参考

F：reaction编码

G：reaction名字

H：reaction公式

I：相关基因

J：reaction所处的subsystem（例如酪氨酸代谢）

E：酶的EC号

L：置信度， 4 = most confident; 0 = unassigned confidence

注：1，由于单细胞计算量非常大，作者提供了一个micropooling脚本，将细胞划分为簇，以簇的平均值代表这类细胞，然后进行分析。

2，You may also apply Compass to bulk transcriptome data sets (e.g. bulk RNA-seq or microarray data sets) if there are enough observations (samples) to gain statistical power。可以用在常规转录组，甚至芯片数据集上。

有单细胞测序数据、常规转录组测序数据、芯片数据、代谢组数据的小伙伴可以试试这款软件。又打开了一个新的免疫代谢相关发文思路！

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