组学知识速递（五）|ChIP-seq知多少？

news2024/11/25 16:45:55

近段时间来，我们合作的ChIP-Seq技术发表的高分成功案例一篇接一篇，您是否心动了呢？本篇文章，总结了ChIP-Seq实验部分重点知识点，开启ChIP-Seq的你绝不要错过！

Q1 什么是ChIP-Seq？

ChIP-Seq即染色质免疫共沉淀-高通量测序，是指通过染色质免疫共沉淀技术（ChIP）特异性地富集与目的蛋白结合的DNA片段，并对其进行纯化和文库构建；然后对富集得到的DNA片段进行高通量测序，是目前在全基因组水平研究蛋白结合靶DNA序列的重要手段，为转录因子、组蛋白修饰等表观遗传学的研究提供有效方法。

Q2 ChIP-Seq实验流程？

Q3 ChIP-Seq样本量要求？

Q4 样本制备需要特别注意的点？

1）单文库样本量样本交联时，甲醛的用量（280μl）、终浓度（37%）以及交联的时间（10min）一定要严格按照流程来；

2）甘氨酸用纯水现配现用，使用之前一定要确保配好的甘氨酸没有结晶；

3）交联好的样本一定要液氮速冻后，再转入-80°C保存；

4）做转录因子的ChIP-Seq必须准备交联的样本。

Q5 为什么要用甲醛交联？

甲醛交联能更好的保存蛋白质与DNA的互作状态，保存细胞原始状态下目的蛋白在染色体的定位，确保信息不丢失。

Q6 ChIP-Seq如何设置对照？各对照目的是什么？

1）input：样本经过超声，但是没有进行ChIP，包含样本超声后总DNA，可以进行电泳，检测超声效果，同时，可以与最后ChIP样本进行比较，看ChIP的效率（如果用同一引物进行PCR，ChIP组和input组亮度差不多，说明ChIP效率高，基本上，样本中所有的目的基因片段都被ChIP下来了，反之，说明效率低，实验条件有待改进）。设置input组是因为超声破碎过程中DNA的断裂不是随机的，尤其是一些开放染色质区域在超声样本中优先累积，已发表文章结果表明未经过IP的样本超声破碎后会产生数量不小的peaks。同时，IP过程中会有非特异性结合的情况，Input对照可以协助排除IP结果中的假阳性peaks。

2）阴性对照：用普通的IgG做为抗体，理论上不会ChIP下来任何DNA片段，因此作为阴性对照，但是由于非特异结合，或者实验过程中，没发生结合的DNA清除不完全，可能也会出现条带。目前，做ChIP-seq，其阴性对照组不会做后续高通量测序，一般Qbit检测不到DNA浓度即判断为阴性对照结果良好。

Q7 抗体如何选择？

一定要选择ChIP-seq级别抗体！抗体研发成功后会进行WB、IP、IHC、ChIP-qPCR、ChIP-seq等实验，并且标注在产品上。

Q8 没有ChIP-Seq级别的抗体，可以用WB级别的么？

不建议使用WB级别抗体做ChIP实验，一个是WB抗体浓度低会破坏ChIP的体系；一个是WB的蛋白是加热变性后的结构，ChIP实验中最好用天然蛋白做的抗体去结合生理状体下的蛋白质。

Q9 实在没有合适抗体的情况下怎么办？

1. 查文献，获取成功用于ChIP-Seq的抗体；

2. 可以考虑构建标签蛋白（His、Flag、HA）融合蛋白表达质粒，目的蛋白和标签蛋白在受体材料中融合表达后，利用标签特异性抗体捕获标签蛋白-目的蛋白—DNA复合物。

但是标签系统有一定的风险性：

1）可能存在标签蛋白分子量太大空间位阻影响目的蛋白和DNA的结合；

2）可能存在标签蛋白和DNA结合的风险；

3）内源性目的蛋白和标签目的融合蛋白竞争性结合DNA，导致富集位点减少。

Q10 哪些网站可以查询抗体信息？