本文介绍荧光信号采集的2种方法。

荧光信号采集是生化类医疗设备（PCR，荧光免疫分析仪）常用的功能，针对不同类型的激发光和发射光采用的荧光信号采集方法也不一样。

1.基本概念

1)发光原理

当待测物质受到外接某一波长的入射光照射后，待测物质的价电子吸收光能由较低能级跃迁到较高能级，进入激发态。当价电子跃迁过程经历的时间约为10^-15s时，跃迁过程中2个能级间的能量差正好等于被吸收的光能量。由于激发态的分子出于不稳定状态，它将会通过无辐射跃迁和辐射跃迁的方式返回到基态，辐射跃迁的过程将会伴随光子的发射，即产生荧光或磷光。

如PCR常用的荧光染料SYBR Green I的光谱（激发光：497nm，发射光：520nm，这里的波长是指中心波长，下同）：

做肝功能检查用的吲哚菁绿(ICG)的激发光为780nm，发射光为805nm。这里的激发光已经处于红外波段了。

荧光免疫分析仪所用的试剂卡中物质激发光为365nm（紫外灯），发射光为615nm。

2)激发光与发射光

原理中提到的入射光即为激发光，物质由激发态回到基态辐射发出的光称为发射光。

3)荧光寿命

荧光寿命是指激发光源切断后荧光强度降低到原强度的1/e时所需要的时间。一般情况下，荧光寿命大约是10^-3s级别。

4)斯托克斯位移

物质受激发后发出的荧光波长总是比激发光的波长要长一些的。最大激发光波长与最大发射荧光波长之差，称为斯托克斯位移。如上图的2个波峰之间的距离就是SYBR Green I的斯托克斯位移（23nm）。ICG的斯托克斯位移为25nm。这2种物质的斯托克斯位移都比较小，较小不利于接收端滤光片的设计。而对于荧光免疫分析仪用到的物质斯托克斯位移比较大，达到250nm，接收端滤光片的设计就较为简单。

2.荧光信号采集方法

根据斯托克斯位移的大小，分2种方法。

1)连续采集法

连续采集法适用于斯托克斯位移比较大的这种情况，如荧光免疫分析仪就采用这种方法。

原理：激发光一直照射待测物质，接收端一直对发射光（荧光信号）进行采集。

由于斯托克斯位移比较大，接收端可以很容易的选择一款合适的滤光片（过滤掉激发光及其他杂散光信号）对发射光进行采集，而激发光并不会影响发射光的采集。这样由激发光引起的杂散光就没有或很小。

但这种方法不适用于斯托克斯位移比较小或者激发光和发射光光谱有重叠的情况，如上图的SYBR Green I，这会造成滤光片不好设计或造价昂贵，而且激发光会对接受端信号采集造成干扰，导致信号信噪比比较差。

2)开/关灯采集法

开/关灯采集法适用于斯托克斯位移比较小的情况，如PCR的荧光信号采集就采用这种方法。

原理：激发光打开，激发一段时间，激发光关闭，同时立即对荧光信号进行采集，不断重复这一过程。

注意这里，激发光虽然关闭，但荧光信号仍会持续一段时间（上面讲的荧光寿命）。

由于激发光关闭，加之整个光路结构处于一个暗室，接收端完全不受发射光的影响，此法杂散光极少，采集到的荧光信号质量高，信噪比也高，这里同样要注意采集时间极短，且荧光信号强度随时间逐渐下降。

总结：本文介绍了荧光发光原理及2种常见的荧光信号采集方法。