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多倍体是被子植物基因组进化中的一种持续现象，有助于现存开花植物的多样性。甘蓝型油菜（Brassica napus）是世界上最重要的被子植物油料作物品种之一，起源于Brassica rapa（An）和Brassica oleracea（Cn）的种间杂交。尽管转录组学中基因组优势的趋势开始显现，但多倍体在生殖发育过程中的表观遗传学和小RNA（small RNA，sRNA）调控机制知之甚少。种子是向新孢子体代的关键发育过渡，并随时间发生表观遗传修饰。双二倍体（amphidiploids）种子发育的协调需要祖细胞（Progenitor cell）基因组的表观遗传平衡。虽然DNA甲基化和RNA干扰是支持发育的关键过程，但将它们与种子发育联系起来的许多细节仍在出现，尤其是在异源多倍体中。
2023年05月17日，加拿大曼尼托巴大学生物科学系Mark F Belmonte团队在《The Plant Journal》杂志发表题为“Genomic asymmetry of the Brassica napus seed: epigenetic contributions of DNA methylation and small RNAs to subgenome bias”的研究论文，该研究利用WGBS和sRNA-seq等实验揭示了DNA甲基化和小RNA在甘蓝型油菜种子亚基因组偏好中的表观遗传作用。
标题：Genomic asymmetry of the Brassica napus seed: epigenetic contributions of DNA methylation and small RNAs to subgenome bias（甘蓝型油菜种子的基因组不对称性：DNA甲基化和小RNA对亚基因组偏好的表观遗传贡献）
时间：2023-05-17
期刊：The Plant Journal
影响因子：IF 7.091
技术平台：WGBS、sRNA-seq等
研究摘要
本研究分析了甘蓝型油菜（B. napus）种子发育过程中，An和Cn两个亚基因组以及祖代缩减的基因组（ancestral fractionated genome）中DNA甲基化和小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）图谱的偏好发生率。研究结果表明，Cn亚基因组的siRNA表达和胞嘧啶甲基化的普遍存在偏好，其中Cn亚基因组启动子区域的DNA甲基化尤为富集。此外甘蓝型油菜祖代三倍体亚基因组中的siRNA转录模式是保守的，而在An和Cn两个亚基因组中不保守。从基因组缩减和多倍体化角度研究了甘蓝型油菜种子的甲基化模式与基因、启动子区域、siRNA位点和转座元件（transposable element，TE）相关。本研究为甘蓝型油菜种子发育过程中选择性沉默Cn亚基因组的表观遗传调控提供了证据，并探讨了基因组缩减对甘蓝型油菜种子表观遗传组分的影响。
图1：甘蓝型油菜种子发育的表观遗传模型假设
- 从配子体发生（gametogenesis）到成熟期结束，种子发育可分为5个离散时期：胚珠期（ovule，OV）、球形期（globular，GLOB）、心形期（heart）、绿熟期（mature green，MG）和干种子期（dry seed，DS）。所有五个时期进行sRNA-seq测序分析，同时对球形期（GLOB）和绿熟期（MG）的种子进行全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS），GLOB期和MG期分别代表了形态发生和成熟开始的关键发育转变。
- 共线性图显示了双二倍体甘蓝型油菜基因组中每条染色体最大的连续共线性区，Brassica rapa（Br）的An亚基因组，Brassica oleracea（Bo）的Cn亚基因组。
- 表观遗传保守性的假设模型——基因组的broad共线区表明两个亚基因组之间的高度保守。这些区域的保守可能导致生殖中类似的表观遗传结构。
研究结果
（1）甘蓝型油菜种子甲基化组单碱基分辨率图谱揭示了Cn亚基因组偏好
表1：甘蓝型油菜叶片、GLOB期和MG期种子基因组上1 kb窗口的甲基化百分比
图2：甘蓝型油菜种子发育中的DNA甲基化
- 平均胞嘧啶甲基化水平。显示球形期（GLOB，绿色）、绿熟期（MG，蓝色）和质体（plastidial，灰色）基因组所有覆盖胞嘧啶的平均甲基化。
- 甘蓝型油菜An和Cn两个亚基因组中甲基化缩减的基因组水平：最少缩减（LF）、最多缩减（MF1和MF2）。分位数箱线图显示在CG、CHG和CHH中，叶片、GLOB期种子和MG期种子的共线性区域1 kB窗口中的胞嘧啶甲基化水平。
（2）启动子元件的差异甲基化靶向参与甘蓝型油菜种子碳代谢和发育的基因
图3：在种子发育全过程中，不同基因组元件的DNA甲基化变化。
- 百分比堆积柱形图显示球形期（GLOB）种子和绿熟期（MG）种子以及叶片之间的高甲基化和低甲基化基因（GENE）、1 kb上游调控区（启动子，PROM）和转座元件（transposable element,TE）。分别为GLOB期种子（橙色）或MG期种子（浅橙色）中的高甲基化，GLOB期种子（黄色）或MG期种子（浅黄色）中的低甲基化，GLOB期种子和MG期种子中的高甲基化（深蓝）或低甲基化（浅蓝）。
- 种子发育GLOB期和MG期的启动子差异甲基化基因GO富集分析。深色表示高度富集。
（3）相对于其他蛋白质编码基因，转录因子（TF）低甲基化
表2：RE（TE）、基因体和启动子元件（TSS上游1 kB窗口）、TF基因体和启动子以及siRNA簇的甲基化百分比
（4）缩减的基因组在基因和启动子上表现出不同的甲基化
图4：基因组的DNA甲基化表征：基因、启动子区域（prom）、重复元件（RE）和siRNA位点。
以甘蓝型油菜（Brassica napus）的缩减基因组（最少缩减(LF)、最多缩减(MF1、MF2)）及其对应的亚基因组（A、C）划分的箱型图和晶须图。
（5）种子成熟以转录的siRNA位点数量增加为表征
图5：甘蓝型油菜种子发育过程中的小干扰RNA（siRNA）reads积累
- 种子发育不同时期的文库中总siRNA位点的reads/M（RPM）比例表现出出一致的Cn亚基因组偏好。
- 在种子发育早期，较少siRNA位点占总reads较大比例，而reads在绿熟期（MG）比胚珠期（OV）、球形期（GLOB）、心形期（heart）分布更均匀。
（6）甘蓝型油菜种子中转座元件（TE）和基因启动子区域编码大部分转录sRNA
图6：由转座元件（TE）、基因体和启动子编码的小干扰RNA（siRNA）簇。
- siRNA在种子发育全过程中以一致的Cn亚基因组偏好性积累。
- 源于基因体的siRNA在DS期积累最强，数量少于由启动子区编码的siRNA。
- 启动子区siRNA在绿熟期（MG）表达最为富集，从胚珠期（OV）到MG期表达增加。启动子区域比基因体编码的siRNA表现出更强的亚基因组偏好。
- 对与启动子区域相关的编码基因（每个种子阶段最高表达的500个siRNA簇）进行GO富集分析，该启动子区域编码每个种子阶段最高表达的500个siRNA簇。
（7）祖代基因组缩减对种子发育过程中的siRNA积累影响不大
图7：种植发育OV期、GLOB期、heart期、MG期和DS期的最少缩减（LF)和最多缩减（MF1和MF2）基因组＞1 read/M（RPM）siRNA位点小提琴图
（8）基因组缩减对非蛋白编码元件的影响小于对基因体和启动子区域的影响
图8：在CHG和CHH甲基化环境中，基因、启动子、转座元件（TE）和小干扰（si）RNA位点的高度不显著比较（P>0.1，Mann-Whitney-Wilcoxon）。
（a）球形期（GLOB）、（b）绿熟期（MG）、（c）GLOB-MG的比较。
结论
总之，本研究为甘蓝型油菜种子中Cn亚基因组的表观遗传偏好和基因组中非蛋白编码元件的表观遗传调控机制提供了证据。本研究数据表明，基因组缩减并没有实质性地改变转座子和种子发育过程中calling的siRNA甲基化谱。种子的表观遗传结构可能是决定甘蓝型油菜进化轨迹的重要因素，尤其与多倍体作物相关。
关于易基因全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）技术
全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS）可以在全基因组范围内精确的检测所有单个胞嘧啶碱基（C碱基）的甲基化水平，是DNA甲基化研究的金标准。WGBS能为基因组DNA甲基化时空特异性修饰的研究提供重要技术支持，能广泛应用在个体发育、衰老和疾病等生命过程的机制研究中，也是各物种甲基化图谱研究的首选方法。
易基因提供的全基因组甲基化测序技术通过T4-DNA连接酶，在超声波打断基因组DNA片段的两端连接接头序列，连接产物通过重亚硫酸盐处理将未甲基化修饰的胞嘧啶C转变为尿嘧啶U，进而通过接头序列介导的 PCR 技术将尿嘧啶U转变为胸腺嘧啶T。
应用方向：
WGBS广泛用于各种物种，要求全基因组扫描（不错过关键位点）
- 全基因组甲基化图谱课题
- 标志物筛选课题
- 小规模研究课题
技术优势：
- 应用范围广：适用于所有参考基因组已知物种的甲基化研究；
- 全基因组覆盖：最大限度地获取完整的全基因组甲基化信息，精确绘制甲基化图谱；
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参考文献：
Ziegler DJ, Khan D, Pulgar-Vidal N, Parkin IAP, Robinson SJ, Belmonte MF. Genomic asymmetry of the Brassica napus seed: epigenetic contributions of DNA methylation and small RNAs to subgenome bias. Plant J. 2023 May 17. doi: 10.1111/tpj.16254. PubMed PMID: 37195091.
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