易基因｜DNA甲基化揭示应激反应影响婴儿免疫相关基因的表观遗传调控机制 | 表观发育

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2021年，《Brain, Behavior, and Immunity》杂志发表题为“Biobehavioral organization shapes the immune epigenome in infant rhesus Macaques (Macaca mulatta)”的研究论文，该研究通过简化基因组甲基化测序（RRBS）等实验揭示生物行为组织塑造恒河猴仔猴的免疫表观基因组特征。

标题：Biobehavioral organization shapes the immune epigenome in infant rhesus Macaques (Macaca mulatta)

时间：2021.08

期刊：Brain, Behavior, and Immunity

影响因子：IF 19.227

技术平台：RRBS

样本实验：154只3-4个月龄的恒河猴仔猴（82只雄性）

图1：数据分析。数据收集和分析各阶段的甲基化数据和主要自变量（笼子观察量表、人类入侵者量表、皮质醇样品）流程图。缩写：IV表示Independent variable，自变量。

摘要：

如何应对压力与其健康状况息息相关。据推测，早期应激反应有助于促进发育机体健康，但应激反应与发育过程中早期免疫功能之间的关系尚不清楚。本研究首先假设应激反应可能影响婴儿期免疫基因的表观遗传调控，为此，作者研究了154只恒河猴仔猴（3-4个月大）的行为反应和下丘脑-垂体-肾上腺应激反应是否与表观基因组免疫细胞DNA甲基化模式相关。在标准化的生物行为评估过程中收集仔猴的行为和生理反应，包括临时迁移及与猴妈妈和社会群体分离。利用简化基因组重亚硫酸盐测序（RRBS）从分离后2小时内收集的血液DNA进行全基因组DNA甲基化定量分析。通过简单回归、控制免疫细胞计数的多元回归和置换回归（permutation regression）进行表观基因组分析（均校正错误发现率）。在分析的变量中鉴定出20368个特异性位点（在9040个基因中）甲基化与三种分析中的至少一种行为反应或皮质醇检测显著相关。免疫系统过程本体（ontology）类别中的442个基因与趋化因子和细胞因子信号基因通路介导的炎症中94个基因存在显著关联。在用于进一步研究的35个候选基因中，有13个基因具有至少一个甲基化与行为反应或皮质醇显著相关的位点，包括糖皮质激素受体基因中的两个内含子位点。在社会分离后，甲基化与第二天情绪行为（第2天情绪，β=−0.39，q<0.001）和皮质醇反应（样本1；β=−0.33，q<0.001）呈负相关。总之结果表明，生物行为应激反应可能与表观基因组发育有关，免疫细胞DNA甲基化可能是应激反应模式影响健康和免疫功能的表观遗传调控机制。

研究亮点：

• 全基因组20000多个位点的甲基化与生物行为检测相关。
• 多种免疫相关基因甲基化可预测生物行为应激反应。
• 在非免疫通路中发现许多甲基化-生物行为学相关联。

研究结果

（1）免疫系统过程和炎症通路基因研究

表1：免疫系统过程注释类别中甲基化与行为反应、甲基化与皮质醇之间的选定关联。

该表显示免疫系统过程注释类别（PANTHER数据库）中与简单线性回归、免疫细胞计数的多元回归控制和置换回归中的行为反应或皮质醇显著相关位点汇总，仅显示启动子附近区域位点。

图2：免疫相关注释类别中的选定的感兴趣的关联。

该图显示了免疫系统过程中的生物过程注释类别（图A左）和趋化因子和细胞因子信号通路介导的炎症中与转录功能相关的基因组区域（图B右）中三个选定位点的原始数据，β值表示所示自变量和因变量之间关联的简单回归的β权重。缩写：D1 Emo表示第1天情绪；HI Act表示人类入侵者活动；HI Agg表示人类入侵者攻击；Samp3表示皮质醇样品3（分离后23.5小时，地塞米松后16.5小时）；Samp1表示皮质醇样品1（分离后2小时）。

表2：由趋化因子和细胞因子信号通路介导的炎症中甲基化和行为反应以及甲基化和皮质醇之间选定的感兴趣的关联。

仅显示5‘UTR、3’UTR和启动子附近及下游区域的位点（启动子200、启动子1500、下游200、下游1500）

（2）PANTHER过表达分析

图3：显著过表达的PANTHER生物过程。该图显示了在所分析的自变量中显著过表达的PANTHER生物学通路（FDR q<0.05）。缩写：D1 Emo和D2 Emo表示第1天和第2天情绪；HI Agg表示人类入侵者攻击；HI-Disp表示人类入侵者迁移；HI Emo表示人类入侵者情绪；Eosin表示嗜酸性粒细胞计数。

表3：与行为反应或皮质醇显著相关位点的六个过表达PANTHER的GO通路分析

该表显示了在简单回归、免疫细胞计数的多元回归控制和分析的每个自变量的置换回归中的全基因组显著性位点的过表达分析汇总。仅显示了相对于恒河猴参考基因组和分析的位点子集显著过表达通路。Pathway列表示过表达的PANTHER基因通路。IV列表示该通路在与特定自变量显著相关位点中显著过表达。Number of Sig. Genes in Pathway列表示具有至少一个在该位点甲基化与所示自变量显著相关位点的特异性基因数量。Total in Pathway列表示在分析的数据中（或括号中的恒河猴参考基因组中）该通路中有多少基因。Expected in Pathway列表示通路中偶然预期显著命中的基因数量。Fold Enrichment表示通路中观察到的显著命中的数量超过预期基因数的程度。并非所有有显著意义的位点都在PANTHER基因通路中进行了注释，在Attained Sig列中显示的数字对应于基因通路中注释的重要位点数量。FDR q列表示二项式比例检验的过表达p值，并根据错误发现率进行校正。

图4：第1天情绪与通过血管紧张素II 刺激G蛋白和β-抑制蛋白通路的信号传导中两个选定位点甲基化之间的关联原始数据。其中甲基化与第1天情绪相关。β值表示所示自变量和因变量之间关联的简单回归β权重。缩写：D1-Emo第1天情绪。

（3）特定候选基因研究

图5：特定目标候选基因的原始数据。该图显示了四个候选基因的原始数据，其中甲基化与行为反应或皮质醇显著相关。β值表示所示自变量和因变量之间关联的简单回归β权重。

（4）免疫细胞计数分析

图6：全基因组特异性和重叠位点以及跨位点基因的数量。

结论：

本研究通过RRBS等实验在恒河猴表观基因组中鉴定出20368个与应激状态的行为或生理反应相关的特异性位点。研究结果表明，应激反应与免疫系统功能和炎性反应的表观遗传调控相关联。本研究为人类和恒河猴的甲基化-气质关联的表观基因组研究提供了有利证据。作者推测，早期生活应激反应的个体差异可能会对免疫表观基因组产生编程效应，从而影响后期的健康结果。需要继续研究以探索这些表观遗传特征是如何在发育过程中出现，以及其在个体健康和疾病差异中的作用。

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简化甲基化测序(Reduced Representation Bisulfite Sequencing,RRBS)是利用限制性内切酶对基因组进行酶切，富集启动子及CpG岛等重要的表观调控区域并进行重亚硫酸盐测序。该技术显著提高了高CpG区域的测序深度，在CpG岛、启动子区域和增强子元件区域可以获得高精度的分辨率，是一种准确、高效、经济的DNA甲基化研究方法，在大规模临床样本的研究中具有广泛的应用前景。

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技术优势：

• 起始量：100ng gDNA；
• 单碱基分辨率；
• 多样本的覆盖区域重复性可达到85%-95%、测序区域针对高CpG调控区域，数据利用率更高；
• 针对性强，成本较低；
• 基因组CG位点覆盖高达10-15M，显著优于850K芯片。

应用方向：

RRBS/dRRBS/XRBS广泛应用于动物，要求全基因组扫描（覆盖关键调控位点）的：

• 队列研究、疾病分子分型、临床样本的甲基化 Biomarker 筛选
• 复杂疾病及肿瘤发病机制等甲基化研究
• 模式动物发育和疾病甲基化研究

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参考文献：

Baxter A, Capitanio JP, Bales KL, Kinnally EL. Biobehavioral organization shapes the immune epigenome in infant rhesus Macaques (Macaca mulatta). Brain Behav Immun. 2021 Aug;96:256-270.

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