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中国计量大学生命科学学院近期在《Journal of Agricultural and Food Chemistry》期刊上(IF=5.895 )发表的研究论文中，转录组学为深入了解植物对不同金属元素的耐受性奠定了基础，这将指导在农业实践中采取合理的措施。

期刊：Journal of Agricultural and Food Chemistry

农林科学领域的top期刊，中科院1区

发表时间：2022

样本类型：菜豆根系

客户单位：中国计量大学生命科学学院

一、研究背景

重金属 （HMs）已成为主要的环境污染物，可以通过自然地球化学循环、微生物和人类活动（如采矿、能源生产或农业）可以进入环境。导致作物产量显著降低和食品安全问题。了解植物对 HM 胁迫的反应和潜在机制对于采取措施调节植物对 HM 的吸收、分配和耐受至关重要。

二、实验设计

图 实验设计

三、研究结果

1、不同 HM 处理后的形态学和生化变化

50 μM HM处理7天后，与 Na 处理的对照相比，Cd处理的菜豆幼苗表现出最严重的生长迟缓表型（图1A）。除 Zn 处理植株外，所有植株的地上部生物量均相对于对照显著降低，而Cd、Co、Cr和 Ni 处理植株的根系生物量显著降低（图1B）。总体而言，Cd在50 μM的浓度下对幼苗的毒性最大HM（图1）。

图1 各种 HM 处理后的形态学变化

2、显著差异表达基因和多因素基因聚类分析以及GO富集分析

RNAseq结果表明，各处理的生物学重复间均有良好的相关性。差异表达分析发现相对于 Na 处理，每种 HM 处理下的 DEG 总数不等（图2A）。随着时间的推移，除Al、Cu和 Mn 外，7 d处理产生了最大数量的DEG，表明具有累积毒性效应（图2B）。将所有基因分为三组，即对 HM 处理有反应、对处理时间有反应和对其相互作用有反应。确定了1577个基因受 HM 的显著影响（不考虑金属类型），497个基因受处理时间的影响，373个基因受其相互作用的影响。

图2 转录组学数据概述

如图 3A 所示，448个 Co DEG 中富集的 GO term均与光合作用、氧化还原和金属离子结合有关。对于对特定 HM 有反应的DEG，仅在 Cd 和 Cu 处理中观察到显著富集的 GO term，其与前者的蛋白质或细胞定位和转运有关，并且主要与后者的 RNA 结合有关（图3B）。对 HM 处理有反应的基因在水解酶、磷酸酶活性、转运蛋白和蛋白质折叠过程中大量富集，而对处理时间和时间×HM相互作用有反应的基因主要与光合作用和光系统功能有关（图3C）。

图3 HM条件下 DEG 的 GO 富集分析

3、WGCNA 揭示了本基因表达和特定 HM 治疗方案之间的关联。

探索各种 HM 处理下的基因共表达网络，确定了22个共表达模块。其中 Cd-6 h 在功能上与脂质代谢和转移酶活性有关，Cu-7 d高表达的与金属离子转运、大分子代谢、基因调控有关，Cd-30 h高表达与ATP、自噬、磷酸化和激酶活性相关，Mn-7 d与氧化还原酶和抗氧化活性有关（图4）。

图4 共表达模块的基因表达和功能注释

4、HM-应答基因中启动子功能的验证

研究选择了与拟南芥 GIP1 同源的基因Phvul.001G120800 ，该基因可以编码 G box结合因子 (GBF) 相互作用蛋白1。根据转录组数据，该基因在菜豆根中被 Cd 显著诱导（图5A）。qRT-PCR分析和表达 GFP 信号的转基因根的 GUS 活性检测（图5D）结果表明，PvGIP1 启动子活性确实是 HM诱导的。

图5 基于毛状根转化系统的 PvGIP1 启动子活性检测

5、一种新的 Cu和 Cd反应基因的功能验证

选择了另一个编码木葡聚糖内转糖基化酶 (XET) 的Phvul.009G233200(PvXTH23)基因用于功能验证。RNA-seq 表明 Cd 和 Cu 处理显著增强了根组织中 PvXTH23 的表达（图6A）。扩增了 PvXTH23 的 CDS 区域，并将其插入到 pNC-Cam1304-SubC 载体中。结果过表达35S：GFP的对照植株在暴露于50 μM Cd 2天后表现出完全萎蔫的表型，暗示该品种对 Cd 具有超敏反应。但在 PvXTH23-OE 品系中过表达 PvXTH23 显著减弱了这种对 Chl 含量的不利影响（图6D）。总的来说，这些结果表明 PvXTH23 在 Cu 和 Cd 的胁迫下对菜豆起保护作用。

图6 PvXTH23在通过瞬时过表达试验赋予 Cu 耐受性中的作用

四、研究结论

比较了9个 HM 处理 (50 μM) 下菜豆的根转录组，Cd 和 Cu 引发的独特差异表达基因 (DEG)s 数量最多，主要与细胞转运/定位和RNA 结合有关。WGCNA分析确定了6个共表达模块在特定HM×时间场景中表现出异常高的转录本丰度。通过实验验证了基因 GIP1 的启动子活性和 XTH23 在 Cu/Cd 胁迫下的新功能。

WGCNA分析，旨在寻找协同表达的基因模块(module)，并探索基因网络与关注的表型之间的关联关系，以及网络中的核心基因。该高级分析可以应用于转录组、转录组+代谢组、转录组+甲基化等;应用领域广泛比如生长发育、肿瘤发生机制、不同品系的比较、新基因注释、目标基因潜在相关基因的筛选、药物作用靶点研究等。凌恩生物深耕组学技术在各研究领域的应用，拥有经验丰富的组学实验及生物信息分析

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参考文献

Fang P,Hu Y,Xia W, et al. Transcriptome Dynamics of Common Bean Roots Exposed to Various Heavy Metals Reveal Valuable Target Genes and Promoters for Genetic Engineering.Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2023;71 (1):223-233. doi:10.1021/acs.jafc.2c06301