Hydrogen-Bond-Assisted Catalysis: Hydroxylation of Paclitaxel by Human CYP2C8

氢键辅助催化：人类CYP2C8对紫杉醇的羟基化

摘要

紫杉醇（PTX，或称Taxol）是一种广泛用于治疗多种癌症的化疗药物，经过细胞色素P450酶CYP3A4和CYP2C8的代谢转化。CYP3A4催化紫杉醇的芳香族羟基化反应，而CYP2C8表现出不同的反应特征，通过烷烃羟基化生成6α-羟基紫杉醇。尽管紫杉醇的代谢对其抗癌效果有显著影响，但这些转化的详细机制仍然大多不清楚。在本研究中，我们采用了量子力学和分子力学（QM/MM）混合计算来阐明人类CYP2C8对紫杉醇代谢的机制。我们的QM/MM结果显示，CYP2C8对紫杉醇的羟基化遵循一种非典型的反弹机制。紫杉醇C6位的两个氢原子中的任意一个都可以被提取，从而产生一个共同的自由基中间体。尽管随后的反弹障碍异常高，但由于生成6α-羟基紫杉醇（实际产物）的反弹障碍显著低于生成6β-羟基代谢物的障碍，因此不太可能出现立体化学混乱。因此，产物选择性由非速率决定的反弹步骤决定。此外，紫杉醇C7位的羟基在促进氢提取和反弹步骤中起到催化作用。我们的研究还证实，在高自旋六重态下，过渡态具有显著的稳定性，这得益于酶对底物的特定位向。

1. 引言

紫杉醇（PTX），又称为Taxol，是一种基于紫杉烷的化疗药物，以其在治疗多种癌症（包括乳腺癌和卵巢癌）中的高效性而闻名。(1−3) 该药物通过抑制微管解聚，破坏细胞分裂，进而抑制细胞增殖。紫杉醇于20世纪60年代从太平洋红豆杉树皮中发现，并于1992年获批用于临床治疗。(3) 多年来，紫杉醇被广泛使用，凭借其卓越的疗效及在生产、配方和给药策略方面的持续进展，仍是肿瘤治疗中的重要药物。(4−6)

与许多其他药物一样，紫杉醇最终在人体内发生代谢转化。实验证据表明，紫杉醇在肝脏中的代谢转化主要由两种不同的细胞色素P450（P450）同工酶催化：CYP3A4和CYP2C8。(7−10) 如图1所示，这些P450同工酶的代谢位点和反应类型有所不同。CYP3A4催化与3′位碳相连的苯环的对位芳香羟基化，生成3′-对羟基紫杉醇。而CYP2C8则靶向6位碳的C–H键，催化烷烃羟基化，生成6α-羟基紫杉醇。

示意图1：紫杉醇（PTX）及其在CYP3A4和CYP2C8代谢中的代谢物的化学结构

理解药物或候选药物的代谢特征对于阐明其药理性质和提高药物发现过程的质量至关重要。(11) 然而，代谢过程通常涉及复杂的化学反应，电子的量子力学行为在其中起到了比传统分子对接方法中非键合的蛋白-配体相互作用更重要的作用。我们的研究团队一直在探索P450酶在药物代谢中的电子特性，研究它们的代谢转化机制(12)和酶抑制过程。(13−15)

深入理解紫杉醇的代谢尤为重要，因为它与抗癌活性、神经毒性和其他不良反应有着密切的关联。(16−18) 尽管紫杉醇的代谢具有重要意义，但针对P450催化紫杉醇代谢的机制研究仍然有限，知识领域存在较大的空白。一个值得注意的例外是我们最近对人类CYP3A4催化紫杉醇芳香羟基化的研究，该研究采用了量子力学和分子力学（QM/MM）相结合的方法。该计算研究提供了有价值的机制见解，揭示了反应从σ复合物的形成开始，接着生成环氧化物或酮。(12) 虽然从CYP3A4代谢中获得的机制见解不能直接应用于CYP2C8的完全不同的代谢过程，但可以利用相同的计算技术来探索这些复杂的代谢途径。在我们对CYP3A4研究的基础上，本研究深入探讨了CYP2C8催化紫杉醇代谢的机制，特别关注酶内的烷烃羟基化反应。

值得注意的是，过去二十多年来，基于密度泛函理论（DFT）和QM/MM计算的P450催化的烷烃羟基化反应的计算研究显著推进了我们对反应性化合物I（Cpd I）物种的理解。(19−37) 然而，大多数计算研究集中在细菌P450上，仅有少数研究考察了人类P450在药物代谢中的作用——这一功能与人类健康直接相关。(24) 人类P450与细菌P450在多个关键方面存在显著差异：它们的活性位点体积更大，底物化合物也更大，X射线晶体结构的获取更加困难，导致结构信息更为匮乏。因此，尽管催化循环在各类生物体中是保守的，(38,39) 但药物化合物的代谢转化仍然远未被完全理解。这突显了对人类P450的进一步QM/MM研究的必要性，以促进代谢引导的药物设计。(11) 对CYP2C8催化紫杉醇代谢的研究正符合这一重要研究方向。

2. 计算方法

2.1. 模型准备

目前尚无CYP2C8与紫杉醇（PTX）复合物的晶体结构。因此，我们最初从蛋白质数据库（PDB, RCSB PDB: Homepage）中选择并比较了与不同大小配体结合的四个CYP2C8晶体结构——分别是PDB代码2NNH、2NNI、2VN0和2NNJ。(40) 其中，2NNH、2NNI、2VN0和2NNJ结构分别包含9-顺式维甲酸（50 × 2 = 100个原子）、孟鲁司特（77个原子）、曲格列酮（58个原子）和非洛地平（44个原子）。尽管结合的配体大小不同，这四个晶体结构在骨架结构以及氨基酸残基的构象上显示出显著的相似性（图S1）。因此，与CYP3A4相比，活性位点柔性对紫杉醇结合的影响不被认为特别显著。(12)

在分子对接模拟中，我们使用了MOE 2020。(41) 与我们之前的方法一致，(12) 我们使用了AMBER10:EHT力场，第一步采用代理三角形和伦敦dG方法，第二步采用刚性受体和亲和力dG方法。正如预期的那样，对接模拟在不同结构中产生了相似的结果。然而，由于2NNJ结构为排名最高的构象提供了略高的对接评分，我们选择使用2NNJ结构进行分子动力学（MD）模拟。

MD模拟用于优化对接结构，基本方法与我们之前的研究相同。(12) 在MD模拟中，我们使用了Amber20(42)和之前报道的P450中间体的力场参数。(43) 此外，我们还使用了最近用于PTX的参数。(12,44) 我们对五配位铁-血红素复合物以及与PTX复合的Cpd I进行了MD模拟。MD模拟的更多细节可在补充信息中找到。

2.2. QM/MM计算

在我们对CYP2C8催化紫杉醇（PTX）羟基化的QM/MM机制分析中，采用了双层ONIOM(QM:MM)方法。(45,46) CYP2C8–PTX复合物的初始几何结构来源于前述的对接和分子动力学（MD）模拟。为降低QM/MM计算的成本，去除了酶球外的溶剂水分子。在ONIOM计算中“真实系统”和“模型系统”的定义与我们之前的研究方法相同。(12) 因此，该系统总共包含7956个原子，其中156个原子通过密度泛函理论（DFT）进行量子力学处理（图S4）。据我们所知，这是迄今为止在P450的QM/MM研究中使用DFT处理的最大原子数量之一。所有ONIOM QM/MM计算均使用Gaussian 16软件进行。(47) 在ONIOM计算中，使用Gaussian默认的AMBER和TIP3P参数来描述氨基酸残基和水分子的MM部分。(48,49) PTX和血红素基团的力场参数与MD模拟中相同。本研究中还考察了几个低能自旋态（双重态、四重态和六重态）。几何优化和振动频率计算采用基于B3LYP/6-31G(d) DFT方法的ONIOM机械嵌入方案（ONIOM-ME），而单点能计算则采用电子嵌入方案（ONIOM-EE）和B3LYP/def2-TZVP DFT方法。(50−56) 为简化表示，几何优化的ONIOM能量和单点能计算的ONIOM能量分别记为E1和E2。通过频率计算获得298.15K和1 atm条件下的自由能修正值(Gcorr)。此外，使用DFT-D3BJ方法计算模型系统中QM原子的色散能(Edisp)。(57,58) 自由能G定义为E2、Edisp和Gcorr的总和，并用于比较不同物种的相对稳定性。

3. 结果与讨论

3.1. PTX的结合构象

图1a突出显示了PTX在C6位的两个氢原子，它们是潜在的氢提取位点。此外，图1b展示了通过分子对接模拟得到的PTX在CYP2C8活性位点内的两种代表性结合构象（A和B）。文献中的实验结果(59,60)（我们通过核磁共振光谱重新检验，见图S2）证实，CYP2C8介导紫杉醇代谢形成的代谢物是6α-羟基紫杉醇（见示意图1）。因此，C–Hα键（图1a）可以被认为是羟基化的位点。然而，在我们的分子对接模拟中，构象A被识别为主要结合结构（图1b），其中Hβ原子处于适合被Cpd I的假定氧配体提取氢的位置，而Hα原子则远离氧配体。相反，在另一种构象（构象B）中，Hα原子更靠近氧配体，与实验结果更一致。尽管如此，构象B的对接评分（−14.1 kcal/mol）略低于构象A（−15.5 kcal/mol）。这一明显的矛盾可以通过考虑PTX在孤立状态下的相对稳定性来解释。结合亲和力本质上反映的是复合形成前后状态的自由能差异，但对接评分可能无法完全反映配体在复合形成前的构象。我们额外的DFT计算表明，构象B中的PTX结构在孤立状态下比构象A更稳定，差异为7.9 kcal/mol（表S1），这表明构象B代表了更稳定的结合模式。因此，选择构象B进行进一步的QM/MM分析。尽管构象A似乎不代表实验观察到的6α-羟基紫杉醇产物的催化相关路径，但该构象的反应已在其他地方被研究。

图1. (a) 紫杉醇（PTX）C6位的两个不同氢原子（Hα 和 Hβ）的示意图。 (b) 通过分子对接模拟获得的代表性构象（A 和 B）。括号中的数值表示对接评分（单位为kcal/mol）。

在通过分子动力学（MD）模拟优化构象B的结构后，进一步使用QM/MM方法对其进行了优化。图2a展示了CYP2C8 Cpd I与紫杉醇（PTX）之间反应复合物（RC）的优化结构，处于双重自旋态。在这一优化结构中，紫杉醇舒适地位于CYP2C8的活性位点腔内，展现了良好的结构互补性。紫杉烷基部分位于血红素上方的大空间中。图2b中的二维配体相互作用图进一步显示，紫杉醇C3’位的苯甲酰胺基团很好地容纳在由Ser103和Thr107等残基定义的小亚口袋中。C2位的苯甲酸基团适合在由Ser100、Pro367及其他残基包围的小空间内。尽管未观察到紫杉醇与残基之间的直接氢键，水分子充当了桥梁，促进了紫杉醇与周围多个残基（如Ser103、Asn204、Ala297、Glu300和Gly365）之间的相互作用。此外，Ile113、Leu208、Val296、Val362和Val366在创建对于底物结合至关重要的疏水环境中也起到了重要作用。

图2. 双重自旋态下的RC 1的QM/MM优化结构。 (a) 使用表面模型突出显示PTX可用的空间。 (b) 1的二维配体相互作用图。

PTX在活性位点中的取向表明C6位氢原子适合进行随后的C–H键活化（图2a）。氢原子与氧配体之间的距离较短：O–Hα距离为2.66 Å，O–Hβ距离为2.78 Å。在MD模拟过程中，O–Hα和O–Hβ的距离保持稳定（图S3）。该RC结构的一个显著特征是PTX C7位羟基（见示意图1）与Cpd I的氧配体之间形成了一个氢键。此氢键相互作用的存在引发了一个有趣的问题，即它在代谢转化过程中对氢活化反应性的潜在影响，这将在后文中详细探讨。

3.2. 氢提取步骤

通常，P450催化的烷烃羟基化始于从C–H键提取氢原子。(19−21) PTX在C6位有两个氢原子，它们可能被Cpd I提取（图1a）。为了评估这两种氢提取方式的能量屏障，我们考察了相关的自由能分布。图3展示了这些能量分布，显示C–Hα和C–Hβ键的氢提取反应分别通过双重自旋态下的过渡态22和22b进行。这两条路径的能垒高度相似，22的相对能量为22.9 kcal/mol，而22b为23.0 kcal/mol。使用纯ONIOM能量（E1或E2）计算时，这些能垒高度大约在28 kcal/mol或更高，远高于P450反应中通常观察到的能垒（表S9）。(20,23−36) 这表明在反应过程中PTX在酶活性位点内存在几何应力。然而，结合色散和自由能修正后，反应的自由能障碍有所降低（表S6）。使用活性位点模型进行的DFT计算也显示，氢提取障碍仅约为10 kcal/mol，进一步突显了酶活性位点的显著影响（表S3）。对PTX结构的详细检查显示，Hα和Hβ原子分别位于环己烷环的赤道和轴向位置，导致这些氢原子处于略有不同的局部电子环境中。因此，通过22从赤道位置提取氢原子在E1和E2值方面计算为更有利（表S6）。22b物种通过其相对较小的Gcorr值得到稳定，可能反映了此过渡态结构较高的灵活性。因此，这两个过渡态表现出相似的稳定性，氢提取可能发生在任一C–H键上。氘实验可能有助于验证这一理论预测。

图3. QM/MM计算得到的从C–Hα和C–Hβ键提取氢的自由能分布图（单位：kcal/mol）。

图4展示了过渡态22和22b的优化结构。在这两个过渡态中，C···H···O段都有一定程度的偏离线性，键角（∠C–H–O）在22中为150.4°，在22b中为147.6°。在过渡态22b*之后，我们得到了中间体23b，其稳定性比23低5.3 kcal/mol（见表S6）。对这些中间体的进一步检查显示，23b本质上是23的一个构象异构体，它们的区别仅在于FeOH基团的羟基配体的取向（见图S5）。因此，23b可以很容易地转化为23，表明两条氢提取路径最终会收敛形成共同的中间体23。因此，在这个机制场景中，氢提取步骤并不决定α/β选择性。

图4. QM/MM优化后的2和2b结构。

3.3. 羟基化的整体反应路径

图5展示了PTX C6位C–Hα羟基化反应的完整自由能分布。该反应遵循反弹机制，其中氢提取被认为是速率决定步骤。(62,63) 在氢提取过渡态（2）下，所研究的三个自旋态具有相似的稳定性：六重态物种的能量最低，为20.9 kcal/mol，其次是四重态（22.3 kcal/mol）和双重态（22.9 kcal/mol）。通常情况下，六重态自旋状态下的氢提取受益于增强的交换机制，即C–H σ键轨道中的一个电子（ϕ）转移到铁(IV)-氧的σz2轨道，从而在d块中形成五个未成对电子（见示意图S1）。(22) 尽管这种交换增强机制降低了能垒，六重态过渡态的能量通常略高于低自旋状态。然而，我们最近关于CYP3A4催化紫杉醇芳香羟基化的研究表明，双重态和六重态过渡态的相对能量分别为17.3和16.9 kcal/mol，表明六重态稍微比双重态更稳定。(12) 在当前的系统中，六重态过渡态的稳定性更加显著，62的能量比其他过渡态低几kcal/mol。这表明在当前系统中，六重态在P450反应性中的参与可能性更高。六重态过渡态的增强稳定性可以归因于活性位点内的空间环境。底物的位置和取向使得反应性C–H键直接从上方接近铁(IV)-氧物种，从而增强了铁(IV)-氧的σz2轨道与C–H键轨道（ϕ）的重叠。这种构型有利于六重态在氢提取过程中的稳定性。(22)

图5. CYP2C8催化紫杉醇羟基化反应的QM/MM计算自由能分布图（单位：kcal/mol）。

图5中的能量图还揭示了相对较高的反弹障碍。通常，DFT和QM/MM计算预测P450催化的烷烃羟基化反应的反弹障碍非常低。(23,25−31,34) 具体来说，双重态通常表现出零或极小的障碍，尽管Hui等人最近在P450BM3催化的环状萜烯底物羟基化反应中报告了相对较高的约6 kcal/mol的反弹障碍（双重态自旋，见表S9）。(31) 而在其他高自旋态下，障碍通常最多仅为几kcal/mol。(21−26) 在当前系统中，没有蛋白环境时，反弹障碍约为3 kcal/mol（见表S3）。然而，QM/MM计算得到的反弹障碍显著高于通常的观察结果，所有自旋态下的反弹障碍均超过12 kcal/mol。这些显著增高的反弹障碍归因于CYP2C8蛋白环境的空间限制，增加了反弹步骤所需的能量。

有限的反弹障碍可能导致产物中立体化学的混乱。(63) 为了更深入地探讨这一问题，我们研究了通过反弹从中间体23生成6β-羟基代谢物的路径。图6比较了生成包含6α-羟基紫杉醇（25）和6β-羟基紫杉醇（25b）的产物复合物的反弹路径。该图显示，通过24b的双重态替代路径的反弹障碍为15.9 kcal/mol，显著高于生成6α-羟基代谢物的反弹障碍（12.3 kcal/mol）。这些不同的障碍高度阻止了立体化学的混乱，解释了实验中仅获得6α-羟基代谢物的原因。由于大分子底物被非键合相互作用紧紧束缚，活性位点中自由基中间体的解离也不太可能发生（见图2）。(64) 产物复合物25b的稳定性比25高几kcal/mol。对分离的羟基化紫杉醇分子的附加DFT计算表明，6α-羟基紫杉醇的稳定性略高于6β-羟基紫杉醇。这些结果表明，这些异构体的热力学稳定性差异不大（见表S2）。图7展示了生成6α-羟基化和6β-羟基化代谢物的过渡态（分别为24和24b）的优化结构。值得注意的是，24中形成的C–O键的长度（2.40 Å）比24b*中（2.31 Å）更长，表明6α-羟基化代谢物的过渡态更早，因此更稳定，进一步支持了实验结果。

图6. QM/MM计算的反弹步骤的自由能分布（单位：kcal/mol），显示生成6α-和6β-羟基紫杉醇的路径。

图7. QM/MM优化后的4和4b结构。

3.4. 羟基的催化作用

接下来，我们探讨了紫杉醇（PTX）C7位羟基在催化中的作用，该羟基与Cpd I的氧配体形成了氢键（见图2a）。为了辨别该氢键的影响，我们构建了一个去羟基的修饰模型1，其中羟基被氢原子取代（1h）。使用该模型，我们研究了双重自旋态下CYP2C8催化的羟基化过程（见图8）。反应的第一步仍然是氢提取。图中显示，去羟基底物的氢提取障碍为26.3 kcal/mol，明显高于羟基化底物的氢提取障碍（22.9 kcal/mol，见图3和图5）。先前的QM/MM研究表明，P450 Cpd I的氧配体与水分子的氢键对氢提取过程具有催化作用，使其障碍降低约4 kcal/mol。(65) 在这里，我们观察到羟基在底物内部具有类似的催化作用，将氢提取的障碍降低了3.4 kcal/mol。有趣的是，早期的系统实验研究指出C7位羟基对抑制微管解聚的作用并不显著，因为其酯化处理并未显著改变抑制活性。(66) 因此，虽然C7位羟基在与微管中β-微管蛋白亚基的结合中似乎不发挥主要作用，但我们的QM/MM结果表明它对CYP2C8催化的紫杉醇代谢过程具有重要影响，通过降低速率决定步骤的障碍。这些发现表明，C7位羟基在CYP2C8代谢紫杉醇的过程中对调节其代谢特性具有关键作用。

图8. QM/MM计算的自由能分布图（单位：kcal/mol），用于模拟C7位–OH基团被–H取代的紫杉醇类似物的反应。

这一计算实验还揭示了，6α-和6β-羟基化产物的反弹步骤过渡态之间的能量差（3.5 kcal/mol）在将PTX中的羟基替换为氢后基本保持不变。因此，羟基的氢键效应并不影响产物的选择性。然而，比较两种底物的反弹障碍（见图6和图8）显示，氢键显著降低了反弹障碍，降低了4.4 kcal/mol。羟基化底物（紫杉醇）反弹障碍的降低可以归因于底物自由基向铁上的羟基配体的“拉动效应”，这一效应可能受到电场效应的增强。(67−69) 总体而言，紫杉醇中的羟基在整个反应过程中起到了重要的催化作用，促进了氢提取和反弹步骤。对去羟基底物反应性降低的预测可以通过进一步实验验证。

4. 结论

综上所述，我们的QM/MM计算揭示了CYP2C8催化的紫杉醇烷烃羟基化过程中存在非典型的反弹机制，这是紫杉醇化疗中的关键代谢过程。我们发现紫杉醇C7位羟基具有显著的催化作用，该羟基通过与Cpd I形成氢键，显著降低了氢提取和反弹步骤的障碍，突显其在调节紫杉醇代谢特性中的关键作用。与典型的P450反应相比，6α-羟基紫杉醇和6β-羟基紫杉醇生成过程中显著更高的反弹障碍进一步证明了其非典型行为。尽管这些反弹障碍较高，但其过程的障碍高度差异确保了产物的立体化学在这一非速率决定步骤得到确定，从而有效避免了立体化学混乱。此外，紫杉醇在CYP2C8中的特定位置和取向显著稳定了高自旋六重态的氢提取路径，达到了前所未有的程度。这项研究显著推进了对人类P450复杂化学的理解，并为基于代谢的药物设计奠定了基础。