01摘要

晚期癌症是一种常见的致死性疾病，其特征是明显的遗传异质性1。在这项研究中，我们研究了由内源性和外源性诱变过程引起的基因组特征的进化及其与复杂结构变异（SV）的相互作用。我们叠加了癌症患者匹配序列肿瘤的突变特征和系统发育分析，以确定这些过程的进化动力学。我们发现APOBEC3诱导的突变是克隆性和早期的，而化疗诱导了数百个晚期亚克隆突变的突变爆发。使用基因组图计算工具2，我们观察到形成SV的染色体外DNA（ecDNA）的常见高拷贝数环状扩增子。我们描述了形成SV的ecDNA内APOBEC3诱导和化疗诱导突变的不同时间模式，从而对这些突变过程相对于ecDNA生物合成的时间获得了新的见解。我们发现癌症尿路上皮中大多数CCND1扩增发生在环状ecDNA形成的SV中。形成ecDNA的SVs持续存在，复杂性增加，包含额外的DNA片段，并有助于治疗耐药性的进化。牛津纳米孔技术公司长期读取全基因组测序，然后重新组装，绘制出CCND1 ecDNA结构。CCND1 ecDNA的实验建模证实了其作为治疗耐药性驱动因素的作用。我们的研究结果确定了驱动癌症尿路上皮演变的基本机制，并具有重要的治疗意义。

02图表简介

a、 描述患者WCMIV063 UC进化的系统发育树。每个节点代表SNV（中心）、节点内所有SNV的平均CCF（蓝色数字）和受高影响SNV影响的基因。SBS、DBS和ID签名比例表示为每个节点内的同心圆（分别从外围到中心）。人体图上标明了从不同肿瘤部位采集的样本数量。一个人的插图改编自参考文献1，施普林格·自然·美国。b、 铂化疗诱导和APOBEC诱导的变异的叶/树干变异折叠变化。n=12个肿瘤，P=0.91×10−5。c、 44例化疗后肿瘤中APOBEC3（SBS2和SBS13）、化疗（SBS31和SBS35）和衰老（SBS1）突变特征的克隆性折叠变化。n=28（衰老），n=29（化疗），n=42（APOBEC）。早期/晚期APOBEC化疗：P=0.1×10−7；早期/晚期衰老-化疗：P=0.8×10−4；克隆/亚克隆APOBEC化疗：P=0.3×10−4。d、 APOBEC3诱导、化疗诱导和衰老相关突变的速度倍数变化。n=34（APOBEC SBS），n=30（化疗SBS），=28（APOBEC-DBS），n=24（化疗DBS）患者。APOBEC SBS-化疗SBS:P=0.0139；APOBEC DBS–化疗DBS：P=7.0×10−4.e，倒置和冲积图，描绘了WCMIVG010患者正常尿道上皮和转移性UC肿瘤之间共享的SBS2和SBS13突变（顶部，垂直条）。底部图y轴上的S表示样本标识符。冲积y轴表示SNV计数。施维雅创建的人体膀胱图像(https://smart.servier.com/)改编自Bioicons(https://bioicons.com/)，根据CC BY 3.0许可证。f、 显著基因的dN/dS比值的最大似然估计（q<0.1）。圆圈大小表示整个队列的编码SNV计数。颜色表示APOBEC3诱导的编码突变的比例。TP53具有最高的dN/dS值（插图，右上角）。b-d采用双侧Wilcoxon秩和检验。除非另有说明，否则方框显示中位数和四分位数间距（IQR）；下须表示Q1-1.5×IQR；上须表示Q3+1.5×IQR*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，NS，不显著。

a、 热图显示71例UC肿瘤（x轴）中复杂SV的连接负荷（y轴）。Tyfonas、BFBs和DM根据它们与ecDNA的关联进行分组。热图根据我们队列的平均结负荷进行归一化，并在自然对数中进行缩放。其他复杂的SV，从上到下，包括嗜铬菌、色丛、TIC、准互易对、rigma和pyrgo。b、 描述癌症进化过程中APOBEC3和化疗诱导突变对ecDNA生物发生的影响的示意图。染色体图像由KKT Madhusanka创建，并改编自Adobe Stock(https://stock.adobe.com). c、 与SV共同本地化的kataegic活动的比例。JaBbA鉴定了DM（非ecDNA）事件，但AmpliconArchitecture未将其归类为“周期性”事件。d、 与其他非ecDNA SV上的kataegi和没有SV关联的kataegis相比，ecDNA形成SV上的Kataegic事件显示到最近断点的中值距离明显更短。该队列中形成SVs的ecDNA中值大小为5.56 Mb，用作kyklonas到最近断点距离的上限。katageic事件中所有突变的中位距离被压缩为每个事件一个测量值。双侧Wilcoxon秩和检验。e、 APOBEC3诱导的kyklonic突变（n=147）和化疗诱导的SNV（n=716）在ecDNA形成SV上的VAF分布小提琴图。绘图在分布的最大值和最小值之间延伸。双侧Wilcoxon秩和检验。P<2.22×10−16。f、 在所有形成SV的ecDNA中，样本/VAF片段组合的突变特征的贡献。仅显示突变>100的部分。g、 WCMIVG035S01患者ecDNA形成SV，携带≥1个kyklonic事件。CN轨迹：JaBb一个基因组图，显示了圆形ecDNA事件中具有SV连接（水蓝色边）的重排DNA片段（灰色顶点）的CN。Kyklonas追踪：kyklonic突变的标准化VAF。非聚集轨道：形成SV的ecDNA上非聚集APOBEC3诱导和铂诱导的特征突变的标准化VAF。

a、 先前研究中分析的WCM膀胱癌症（BLCA-WCM）队列、BLCA-TCGA队列和TCGA/PCAWG泛癌亚群队列中CCND1扩增样本中圆形、高度重排、线性或非环状扩增子的分布22。b、 上图为p16-cyclin D1-CDK4/6-Rb通路示意图。71例UC肿瘤中染色体区域9p21.3（CDKN2A）、11q13.3（CCND1）以及基因CDK4、CDK6和RB1的底部标准化CN改变热图。染色体区域和基因没有按比例绘制。c、 CCND1和LTO1 mRNA表达正常。d、 化疗后（化疗后）肿瘤中ecDNA形成SV事件（高达3MB）的平均JCN（P=0.016）和最大JCN（P=0.032）明显高于化疗前（化疗前）肿瘤中的ecDNA形成SV-事件。n=12个肿瘤中的15个事件。双侧Wilcoxon秩和检验。每个点代表一个ecDNA形成SV事件。e–h，AmpliconArchitecture（顶部轨道）与JaBbA（CN和读取深度轨道）的组合基因组图。JaBbA轨迹显示了原发性膀胱肿瘤全身治疗前（e，g）和后（f，h）患者WCMIV091（e，f）和WCMIV076（g，h）的DNA片段（黑色顶点）的染色体位置和CN改变以及相应的JaBbA SV事件（彩色边缘）。作为临床试验的一部分，患者WCMIV091接受了CDK4/6抑制剂新佐剂abemaciclib治疗4周。患者WCMIV076接受了吉西他滨（Gem）和顺铂（Cis）的新辅助组合。右上图显示，在患者WCMIV091中，FGFR1与CCND1在相同的ecDNA中重排，而在患者WCMI V076中，FGF19和CCND1则在ecDNA中共扩增。CCND1、FGFR1和FGF19的染色体位置以红色突出显示。

a、 在UMUC3膀胱癌症细胞系中使用非整合CCND1游离型慢病毒载体转导和竞争测定的实验示意图，通过Incucyte活细胞成像和单细胞10x RNA测序监测。b、 96小时内mCherry CCND1游离ecDNA与GFP空细胞的比率，表明CCND1 ecDNA具有选择性优势。n=每口井25个区域。双侧非配对t检验。数据为平均值±标准差。在0-96小时的每个6小时点，FDR调整后的P=0.02、0.11、0.12、0.047、0.022、0.0083、0.0013、0.00031、0.00021、7.1×10−5、8.0×10^6、7.0×10^-6、7.0×10-6和1.3×10-5.c，均匀流形近似和投影（UMAP）（左）和箱线图（右），比较单细胞中E2F靶基因表达得分与GFP空对照（载体n=7602，顺铂n=8177）和mCherry CCND1 ecDNA（载体n=8177 8336，顺铂n=4320）在顺铂（P=0.3×10−91）和赋形剂（P=0.3±10−49）治疗下。双侧曼-惠特尼检验。d、 气泡图显示了在载体和顺铂处理下GFP空对照和mCherry CCND1 ecDNA样品之间差异表达基因的富集基因集。气泡大小表示NES值。黑色边框表示显著性（FDR q<0.01）。e、 JaBbA检测和AmpliconArchitect确认SF295细胞系中形成DM事件的周期性ecDNA。f、 中期FISH显示ecDNA上CCND1扩增。n=1个独立实验。比例尺，10µm。g、 SDS-PAGE蛋白质印迹验证CCND1敲除。n=3个独立实验。凝胶源数据见补充图1。h、 在顺铂选择和Incucyte活细胞成像监测下的竞争试验中，CCND1 shRNA和加扰shRNA控制同源细胞系的示意图。i、 用shRNA介导的CCND1敲除处理mCherry阳性细胞96小时后的细胞比率与用加扰shRNA对照处理GFP阳性细胞相比，显示CCND1敲除细胞的适应性降低（P=0.034）。n=每口井25个区域。单侧非配对t检验。数据为KeHan创建并改编自Bioicons的六孔板图像的平均值±标准差

03 参考文献
Liu Y , Qin Z , Yang X ,et al.High-Voltage Manganese Oxide Cathode with Two-Electron Transfer Enabled by a Phosphate Proton Reservoir for Aqueous Zinc Batteries[J]. 2022.

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