大家好，今天我们来聊聊一项4D 活细胞生物打印技术——《Jammed Micro-Flake Hydrogel for 4D Living Cell Bioprinting》发表于《Advanced Materials》。在组织器官再生应用中，构建具有复杂几何形状和功能的载细胞结构至关重要。而水凝胶基4D生物墨水的发展是关键。现有材料在细胞相容性和刺激条件等方面存在不足。本文介绍了一种新型堵塞微片水凝胶，它作为载细胞生物墨水，在4D生物打印中有出色表现，有望为组织工程开辟新的应用领域。

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一、引言

4D打印是从3D打印发展而来的新兴领域，其打印结构在特定刺激下会发生形状、属性或功能的转变。4D生物打印旨在构建具有复杂几何形状和功能的载细胞结构，用于组织/器官再生，但目前用于4D生物打印的生物墨水仍有待开发。

水凝胶作为生物墨水具有多种优势，但在挤出式打印中存在一些问题，如打印分辨率、形状保真度和喷嘴堵塞等。微凝胶作为水凝胶构建的基础，具有非球形、非均匀形态的堵塞微凝胶可能提供更好的生物打印构建形状稳定性，但微凝胶用于4D生物打印尚未被研究。

二、实验内容

（一）材料制备

OMA的合成与交联：合成理论氧化和甲基丙烯酰化分别为1%和30%的OMA，与钙离子（Ca²⁺）完全交联形成离子交联水凝胶。

MFH的制备：通过简单混合制备MFH前体，储存在70%乙醇中，重构后转变为具有片状形态的堵塞状态。

（二）性能测试

流变性能测试：

实验过程：使用Kinexus ultra +流变仪对MFHs进行动态流变学检查，包括振荡频率扫描（0.1-100 Hz，1%应变）和振荡应变扫描（0.01-100% 应变，1 Hz），以及进行循环变形测试（100%应变与1%应变交替，各1分钟，1 Hz）。

实验结果：MFHs在低剪切应变下表现出固体状行为，在增加剪切速率或剪切应变> 10% 时显示出典型的剪切稀化和剪切屈服行为，且具有快速自愈合能力。MFHs能够通过针头均匀挤出，形成均匀细丝并打印成稳定的3D结构。

4D生物打印：

实验过程：使用改装的3D打印机打印无细胞和载细胞的生物墨水，打印后的构建物立即在紫外线下光固化，然后转移到6孔组织培养板中进行进一步培养以记录形状变化。

实验结果：MFHs可以顺利打印成稳定的3D生物构建物，且可进一步交联形成交联梯度。

（三）形状变形行为研究

以水凝胶条为原型的研究：

实验过程：打印具有梯度交联密度的水凝胶条，研究其在不同介质（去离子水、PBS和细胞生长培养基）中的形状变形行为，考察结构尺寸、打印参数、UV交联时间等对弯曲角度的影响。

实验结果：水凝胶条在不同介质中的弯曲角度不同，去离子水中最快且角度最大，PBS 次之，细胞生长培养基中最小。填充密度越高，弯曲角度越大；UV照射时间越长，弯曲角度越小；水凝胶条长度增加，弯曲角度增大，而宽度变化对弯曲角度影响较小。

外部刺激对形状的控制：

实验过程：将梯度水凝胶条先在PBS（pH 7.4）中孵育形成曲线，然后转移到不同pH 的PBS溶液中记录形状变化。

实验结果：水凝胶条在低pH（2.0）下迅速拉伸并弯曲，然后重新拉伸并收缩，最终达到平衡状态；在pH恢复到7.4时，水凝胶条缓慢恢复到初始状态。该水凝胶在低pH刺激下可实现多次形状转变，且在多个循环中没有显示出疲劳迹象。

细胞相容性实验：

实验过程：将三种类型的细胞（NIH3T3、HeLa和hMSCs）与含有PI和UV吸收剂的 MFHs 混合并打印成水凝胶条，培养后观察形状变化和细胞存活情况。

实验结果：打印的载细胞水凝胶条与无细胞对应物具有相当的弯曲能力，封装的细胞在培养24小时后仍具有很高的存活率。

复杂几何形状生物构建物的制造：

实验过程：通过结合基于掩模的光刻技术或复杂的生物打印几何设计，制造具有更复杂几何形状的生物构建物，如“生物螺旋”、“生物S”结构、“伪四瓣”和“伪六瓣”花朵、类似于人类肋骨笼的弯曲笼和“网管”等。

实验结果：这些4D工程生物构建物非常坚固，即使在强烈搅拌下也能保持其几何形状。

3D 到 3D 形状变形的演示：

实验过程：打印具有复杂3D结构的“支柱夹具”和“鲨鱼鳍片”等，并通过控制光照射方向和暴露于光的区域在构建物中创建多个位置特定的交联梯度。

实验结果：实现了复杂的3D到3D形状变形，展示了该系统在开发更多可变形3D结构方面的可行性和可靠性。

在组织工程中的应用：

实验过程：培养4D生物打印的包含hMSCs的MFHs以诱导软骨样组织的形成，监测软骨形成过程中载细胞水凝胶条的形状变化和细胞情况，并分析DNA和糖胺聚糖（GAG）的水平。

实验结果：4D生物构建物具有良好的稳定性，GAG产生量与阳性对照组相似但显著高于阴性对照组，意味着形状变形与组织成熟相互独立。

三、结论

本研究开发了一种新型单组分堵塞微片水凝胶（MFH）系统作为4D活细胞生物打印的载细胞生物墨水，该生物墨水具有理想的剪切稀化、剪切屈服和快速自愈合特性，可在生理条件下实现4D形状变化并保持高细胞活力。通过单一的非生物相容性刺激（低pH）可引发多次形状转变，利用该生物墨水制造了具有明确构型的形状变形载细胞生物构建物，并在弯曲的水凝胶条和折叠的四瓣和六瓣花中证明了4D软骨样组织形成。该4D生物打印系统在组织和器官工程中具有应用前景。

参考文献：

Ding A, et al. Jammed Micro-Flake Hydrogel for Four-Dimensional Living Cell Bioprinting. Adv Mater. 2022 Apr;34(15):e2109394.