今天给同学们分享一篇生信文章“PCTAIRE Protein Kinase 1 (PCTK1) Suppresses Proliferation, Stemness,and Chemoresistance in Colorectal Cancer through the BMPR1B-Smad1/5/8 Signaling Pathway”，这篇文章发表在Int J Mol Sci期刊上，影响因子为5.6。

结果解读：

高PCTK1表达与更有利的CRC预后相关

首先，为了探索PCTK1在CRC中的作用，作者使用公共数据库分析了PCTK1表达与CRC临床结果之间的相关性。如图1A（左侧面板）所示，CRC标本中PCTK1的较低表达与GSE41258数据集中的不良预后显著相关（n = 252，p = 0.007）。同样，在图1A（右侧面板）中，对另一个CRC数据集（GSE17538，n = 232，p = 0.018，HR = 0.5（0.27–0.9））的分析也表明，较低的PCTK1导致不良的总生存率。那些PCTK1表达较高的患者具有更有利的生存结果，表明PCTK1作为CRC进展的抑制剂。为了进一步研究PCTK1在调控CRC进展中的机制，作者尝试操纵PCTK1基因，并在CRC细胞中生成稳定过表达PCTK1或沉默PCTK1的细胞系。通过Western blotting确定了不同人类结肠腺癌细胞系（HT-29、DLD-1和HCT116）中的PCTK1表达。如图1B所示，所有的CRC细胞系中都表达PCTK1，但在DLD-1细胞中表达量非常低。因此，根据对不同结直肠癌细胞系中PCTK1表达水平的评估，作者选择了用于接下来的实验的细胞系。接下来，在HT-29细胞中建立了稳定的PCTK1基因敲低细胞系（PCTK-KD）和对照细胞系（乱序对照）。在DLD-1细胞中也生成了对照细胞系（载体）和稳定过表达PCTK1的细胞系（PCTK1-over）。使用Western blotting确认了稳定过表达和敲低PCTK1的细胞系中PCTK1的表达（图1C、D）。此外，使用CRISPR/Cas9技术通过去除外显子2至6来创建了两个结直肠癌细胞系DLD-1和HCT116的PCTK1基因敲除细胞系。

PCTK1表达抑制结直肠癌细胞增殖

接下来，作者检查了PCTK1表达的失调是否影响了CRC细胞的增殖。从RTCA结果构建的细胞指数曲线显示，PCTK1过表达、PCTK1-KD和PCTK1-KO细胞与其对照组之间存在显著差异。在DLD-1细胞中过表达PCTK1导致细胞增殖减少。然而，PCTK1-KD或PCTK1-KO细胞相对于对照组细胞呈现更高的增殖率（图1E-H）。这些功能增强和功能丧失实验的结果表明，PCTK1抑制了CRC细胞的增殖。

PCTK1在体内抑制了肿瘤发生和肿瘤生长。

PCTK1过表达与对照DLD-1细胞以及PCTK1-KO与对照HCT116细胞被皮下植入裸鼠体内，监测其对肿瘤的发生和进展的影响。与对照组相比，PCTK1过表达细胞植入的裸鼠体内的异种移植瘤生长、体积和重量（图2A-C）明显较低。而PCTK1-KO组的异种移植瘤生长、体积和重量（图2E-G）则持续显著高于对照组。通过Western blotting检测，确定了小鼠肿瘤组织中PCTK1的表达情况（图2I）。综上所述，这些结果表明PCTK1在结直肠癌的体内肿瘤抑制中起到了作用。

PCTK1在结直肠癌中负调化疗抗性

化疗是CRC治疗的主流方法[19]。然而，化疗耐药是癌症治疗中的主要障碍，导致癌症复发[20]。作者发现CRC患者的PCTK1水平较低与整体生存率较差相关（图1A）。因此，作者很好奇PCTK1是否在CRC的化疗反应中起到了调节作用。作者对HCT 116的对照组和PCTK1-KO细胞进行了5-氟尿嘧啶（5-FU）和伊立替康（IRI）的不同剂量处理，这是CRC标准一线化疗药物之一。数据显示，细胞存活率呈剂量依赖性下降。然而，在最高剂量的5-FU下，组间细胞存活率的显著差异仅在5-FU组中观察到（图3A）。一些临床研究已经报道，IRI显著降低了5-FU基础治疗对CRC的治疗耐药性[21, 22, 23]。与单一药物相比，已被证明能够取得更好治疗效果的联合化疗方案通常更受欢迎用于mCRC治疗。在不同剂量的IRI处理下，HCT 116 PCTK1-KO细胞的存活率明显高于对照组细胞（图3B）。此外，HCT 116 PCTK1-KO细胞在仅接受IRI治疗和与低剂量5-FU联合治疗时，相对于对照组细胞，细胞存活率增加（图3C）。同样，在仅接受IRI治疗和与5-FU联合治疗时，HCT 116 PCTK1敲除细胞的克隆形成能力也高于对照组细胞（图3D）。为了进一步确定PCTK1对结直肠癌化疗敏感性的影响，使用annexin V/propidium iodide双染法评估了HCT 116对照组与HCT 116 PCTK1-KO细胞在不同化疗方案下的细胞凋亡率。在仅接受IRI单独治疗（32.68% ± 3.17%对23.32% ± 3.98%）和IRI-5-FU联合治疗方案（37.77% ± 3.53%对27.56% ± 1.99%）下，HCT 116 PCTK1-KO细胞的凋亡率较低（图3E、F）。通过Western blotting评估了HCT 116对照组与PCTK1-KO细胞在化疗药物治疗后的凋亡相关蛋白的表达情况。在IRI治疗和IRI-5-FU治疗后，相对于对照组细胞，PCTK1-KO细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2相对Bcl-xL的表达减少，而凋亡蛋白Bax、c-PARP、c-caspase3和p53的表达增加较少（图3G、H）。这些数据表明，PCTK1的敲除通过调节caspase依赖性凋亡抑制了化疗反应。这些结果还表明，PCTK1是结直肠癌治疗中IRI治疗（单独或与5-FU联合）敏感性的预测生物标志物。此外，作者还利用ROC Plotter平台根据PCTK1的表达水平评估结直肠癌患者对化疗治疗的反应。与作者的发现一致，对化疗反应差的患者（p = 0.0068）PCTK1的表达较低。

PCTK1表达改变了结直肠癌细胞的癌症干细胞特性

癌干细胞（CSCs）是肿瘤细胞的一个亚群，能够推动肿瘤的起始并负责维持肿瘤的异质性、增强增殖能力和治疗抵抗性[24]。作者的数据表明，PCTK1抑制了CRC的肿瘤生长和化疗反应。为了评估PCTK1对CRC细胞的CSC特性的影响，进行了克隆形成实验。PCTK1过表达显著阻断了DLD-1细胞的克隆形成，而PCTK1-KO的DLD-1和HCT116相对于对照组具有更强的克隆形成能力（图4A-C）。一项研究报告指出，球体形成是细胞自我更新能力的指标，这是CSCs的定义特征[25]。通过球体形成实验检测了PCTK1对CRC细胞的球体形成能力的影响，其中对照组和PCTK1-KO的HCT116细胞在含有B27、bFGF和EGF的无血清培养基中培养。在干细胞生长条件下，PCTK1-KO细胞形成的球体比对照组细胞更多（图4D,E）。一篇综述文章指出，已有研究涉及到多个表面标记物和多能性转录因子来鉴定CRC中的CSCs[26]。在此，PCTK1-KO细胞的CSC标记物（NANOG、SOX2、Oct4、CD44、CD133和EpCAM）的表达持续上调（图4F）。相反，PCKT1的过表达导致所有这些CSC标记物的显著下调。

PCTK1通过BMPR1B-Smad信号抑制细胞增殖、CSC特性和化疗反应

为了研究PCTK1在细胞增殖和结直肠癌治疗反应中的直接基因靶点和信号通路，对PCTK1过表达和对照的结直肠癌细胞的RNA测序数据进行了GSEA分析。PCTK1过表达与雄激素反应信号通路呈负相关，根据GSEA分析，在雄激素反应基因集中观察到BMPR1B表达的显著降低（图5A）。为了验证这些结果，进行了RT-PCR实验。在HCT 116 PCTK1-KO细胞和异种移植瘤组织中，BMPR1B表达上调（图5B、C）。先前的研究表明，BMPR1B参与TGFβ/Smad信号通路，并与结直肠癌风险相关[27]。BMPR1B激活的受体激活SMAD蛋白（R-SMADs），Smad1/5/8，然后与Smad4形成复合物，并触发其核转位。另一方面，Smad4还可以通过正反馈机制调节经典的BMP/Smad信号通路[28, 29]。因此，作者使用Western blotting评估了HCT 116 PCTK1-KO细胞中Smad1/5/8的核转位。在HCT 116 PCTK1-KO细胞中，Smad1/5/8在细胞核中的表达上调（图5D，E）。GAPDH和PARP分别用作细胞质和细胞核的内部对照。已报道磷酸化的Smad1/5/8-Smad4复合物传递信号到细胞核，然后激活BMPR1B转录[28, 29]。为了进一步阐明Smad1/5/8在PCTK1-BMPR1B轴信号通路中的作用，检测了HCT 116对照组和PCTK1-KO细胞中经Smad1/5/8抑制剂LDN193189和palovarotene处理后的BMPR1B表达。在所有细胞中，LDN193189和palovarotene抑制了BMPR1B的表达，这证实了Smad1/5/8在经典BMP/Smad信号通路中的正反馈机制（图5F）。综上所述，这些结果表明PCTK1通过Smad1/5/8的正反馈机制调节BMPR1B。

BMPR1B敲低部分抑制了PCTK1敲除对结直肠癌细胞恶性表型和化疗抗性的促进

为了确定PCTK1介导的细胞增殖、CSC特性和化疗反应是否由BMPR1B介导，作者使用shRNA转染技术在PCTK1-KO细胞中敲除了BMPR1B。数据显示，BMPR1B的敲除部分逆转了HCT 116 PCTK1-KO细胞的增殖活性和集落形成能力（图6B、C）。此外，与HCT 116 PCTK1-KO/对照-shRNA细胞相比，HCT 116 PCTK1-KO/BMPR1B-shRNA细胞对IRI和IRI-5-FU治疗的细胞存活率降低。然而，HCT 116 PCTK1-KO/BMPR1B-shRNA细胞的细胞存活率高于对照组（图6D）。数据表明，PCTK1通过抑制BMPR1B来抑制细胞增殖、CSC特性和化疗耐药性。为了验证BMPR1B在CRC中的作用，作者进一步从Human Protein Atlas和GEPIA数据集中研究了BMPR1B在CRC的临床结果。数据显示，高表达的BMPR1B与CRC的总体生存率和无病生存率不良相关（图6E、F）。此外，使用Timer 2.0数据集在CRC患者中发现PCTK1与BMPR1B呈负相关（rho = -）。24，p = 1.99 × 10 −7 ) 和 cBioPortal（Spearman相关系数−0.32，p = 2.97 × 10 −10 ）（图6G，H）。

通过小分子药物对BMPR1B-SMAD1/5/8信号通路进行药理靶向，抑制了PCTK1基因敲除对结直肠癌细胞恶性表型和化疗抗性的促进作用。

为了进一步评估PCTK1在结直肠癌细胞表型和化疗反应中通过BMPR1B-SMAD1/5/8的调控作用，作者使用两种SMAD1/5/8抑制剂LDN193189和palovarotene处理了PCTK1-KD HT-29细胞。数据显示，这两种抑制剂都抑制了结直肠癌细胞的增殖和集落形成。然而，PCTK1 KD细胞对SMAD1/5/8抑制剂更为敏感。在存在SMAD1/5/8抑制剂的情况下，控制组和PCTK1 KD细胞的增殖差异在48小时内逆转，并且集落形成的减少在SMAD1/5/8抑制剂处理后也更高（图7A、B）。此外，LDN193189和palovarotene还有效地逆转了PCTK1-KO细胞对IRI-5-FU治疗的化疗耐药性（图7C）。总的来说，作者的数据表明，PCTK1通过BMPR1B-SMAD1/5/8信号通路抑制了结直肠癌细胞的增殖、CSC特性和化疗反应。通过药物抑制BMPR1B-SMAD1/5/8信号通路可以逆转PCTK1敲除对结直肠癌细胞恶性表型和化疗耐药性的促进作用。

总结

作者发现沉默BMPR1B逆转了PCTK1-KO细胞中细胞增殖、CSC特性和化学耐药性的增强。Smad1/5/8抑制剂、LDN193189和帕洛伐替尼治疗降低了PCTK1-KD和PCTK1-KO细胞中的癌症恶性肿瘤和化疗耐药性。总之，作者的研究结果表明，PCTK1通过下调CRC中的BMPR1B–Smad1/5/8信号通路，抑制癌症进展并改善化学反应。