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组蛋白修饰对调控染色质结构和基因表达至关重要，组蛋白修饰失调可能导致疾病状态和癌症。染色质结合蛋白BRWD3（Bromodomain and WD repeat-containing protein 3）是Cul4-DDB1 E3泛素连接酶复合体的已知底物特异性因子，敲除BRWD3会导致H3K4me1（H3 lysine 4 monomethylation）水平增加。然而，连接BRWD3和H3K4甲基化的潜在机制尚不明确。
2023年9月26日，美国范德比尔特大学生物科学系Jared T. Nordman团队在美国国家科学院院刊（PNAS）上发表题为“BRWD3 promotes KDM5 degradation to maintain H3K4 methylation levels”的研究论文。该研究通过染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）等分析揭示了BRWD3促进组蛋白去甲基化酶 5(lysine-specific demethylases 5,KDM5)降解以维持H3K4甲基化水平。
标题：BRWD3 promotes KDM5 degradation to maintain H3K4 methylation levels（BRWD3促进KDM5降解以维持H3K4甲基化水平）
时间：2023-09-26
期刊：Proceedings of the National Academy of Sciences
影响因子：IF 11.1
技术平台：ChIP-seq、ChIP-qPCR、RNA-seq等
研究摘要：
本研究结果显示BRWD3敲除不仅会导致H3K4me1水平增加，还会导致H3K4me 水平降低，表明BRWD3对H3K4甲基化的影响具有广泛性。通过免疫沉淀结合定量质谱分析鉴定出BRWD3与H3K4特异性组蛋白去甲基化酶5（KDM5/Lid）之间的相互作用，KDM5是一种从H3K4中去除三甲基和二甲基标记的酶。此外染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)数据分析显示，BRWD3和KDM5在全基因组中显著共定位，且H3K4me3在BRWD3结合位点高度富集。BRWD3促进K48连接多泛素化和KDM5降解，并且KDM5降解依赖于BRWD3和Cul4。而敲除KDM5完全恢复改变的H3K4me3水平，部分恢复BRWD3敲除后的H3K4me1水平。总之本研究结果表明，BRWD3调节KDM5活性以维持H3K4甲基化水平。
研究方法：
研究结果：
（1）BRWD3影响H3K4单甲基化、二甲基化和三甲基化水平
图1：BRWD3影响H3K4甲基化水平。
A-B. 果蝇S2细胞中H3K4me1（A）和H3K4me3（B）归一化强度（Normalized Intensity）的IF定量分析。每个点表示每个细胞核的H3K4甲基化强度与总DNA含量的归一化。每个分布表示从三个生物学重复中随机选择的1000个细胞的信号强度。使用单因素方差分析和Tukey多重比较检验，P＜0.0001。
C. 无dsRNA对照组（WT）和两种dsRNA敲除BRWD3的S2细胞中产生的g归一化ChIP-seq图谱中的代表性H3K4me3 peaks。
D. peaks归一化H3K4me3-ChIP-seq信号的富集热图，通过所有公布的H3K4me3 peaks中心周围的平均占有率排序。
E. H3标记在BRWD3结合位点内的富集。显示了每个标记peaks集的重叠相对于预期重叠的Log2富集。
F. BRWD3和H3K4me3-ChIP-seq基因轨迹相似性的代表性视图。
（2）BRWD3与H3K4me3组蛋白去甲基化酶KDM5/Lidex的结合
图2：BRWD3和KDM5w位于相同复合体中，结合相同的基因组区域。
- 果蝇胚胎的BRWD3-HA IP的质谱分析流程。
- BRWD3-IP-TMT-MS火山图结果。蓝点表示与阴性对照相比BRWD3-HA-IP显著富。红点表示Cul4-DDB1-BRWD3 E3泛素连接酶复合体。
- BRWD3和KDM5 ChIP-seq轨迹相似性的代表性视图（左）。Venn图量化基因组上BRWD3和KDM5结合位点之间的重叠，P＜0.0001（右）。
（3）BRWD3促进KDM5泛素化和降解
图3：BRWD3促进KDM5的泛素化和降解。
- 在BRWD3-V5共转染（OE）、野生型（WT）或BRWD3-RNAi（KD）条件下，HA标记的KDM5和/或FLAG标记的泛素共转染的果蝇S2细胞的Denaturing IP分析。
- Denaturing IP的免疫沉淀用K48-或K63-连接的多泛素链特异性抗体与抗HA抗体进行联合印迹分析。
- 用表达KDM5-HA的质粒转染S2细胞，并用环己酰亚胺（CHX）单独或与蛋白酶体抑制剂MG-132联合处理。经CHX处理指定时间后，用抗HA抗体进行western blots检测KDM5-HA水平。
- 与C类似，但分别使用BRWD3 RNAi或GFPi RNAi处理。
- 在指定时间点对（D）的三个生物学重复进行KDM5-HA水平定量，归一化为总负载蛋白水平。
- 与C类似，用GFPi-RNAi、Cul4-RNAi或Cullin抑制剂（MLN4924）处理S2细胞。
- 在指定时间点对来自F的三个生物学重复的剩余KDM5-HA水平进行定量分析。
（4）抑制KDM5可以恢复在BRWD3敲除后改变的H3K4me3水平
图4：抑制KDM5可以恢复BRWD3敲除后改变的H3K4甲基化水平。
A-B. 使用抗H3K4me3抗体（A）或抗H3K4me1抗体（B）在果蝇S2细胞中进行定量IF检测的小提琴图。在共敲除中使用了5微克的KDM5 dsRNA。每个分布表示从三个生物学重复中随机选择的1000个细胞的信号强度，使用单因素方差分析和Tukey多重比较检验，****P＜0.0001。
C. BRWD3单个拷贝的缺失导致了依赖于KDM5的Su（var）表型。
D. BRWD3依赖性调控H3K4甲基化水平模型。BRWD3靶向KDM5降解。在BRWD3缺失情况下，KDM5活性增加，导致H3K4me3去甲基化，从而促进H3K4me1水平升高。
研究意义：
H3K4甲基化与基因转录活性相关，但调控H3K4me3水平的机制尚不清楚。本研究分析了BRWD在调控H3K4甲基化中的作用，BRWD3是一种染色质结合蛋白和Cul4DDB1泛素连接酶复合体的底物特异性因子。分析结果显示BRWD3敲除不仅会增加H3K4me1水平，而且还会降低H3K4me3水平。BRWD3与KDM5/Lide（KDM5/Lid是一种主要去除H3K4三甲基和二甲基标记的去甲基化酶）的结合，BRWD3可以通过K48连接多泛素化促进KDM5降解，KDM5共敲除可恢复与BRWD3缺失相关的H3K4me3水平。本研究结果表明BRWD3是调控H3K4甲基化水平维持的关键因子。
关于易基因染色质免疫共沉淀测序 (ChIP-seq)
染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation,ChIP），是研究体内蛋白质与DNA相互作用的经典方法。将ChIP与高通量测序技术相结合的ChIP-Seq技术，可在全基因组范围对特定蛋白的DNA结合位点进行高效而准确的筛选与鉴定，为研究的深入开展打下基础。
DNA与蛋白质的相互作用与基因的转录、染色质的空间构型和构象密切相关。运用组蛋白特定修饰的特异性抗体或DNA结合蛋白或转录因子特异性抗体富集与其结合的DNA片段，并进行纯化和文库构建，然后进行高通量测序，通过将获得的数据与参考基因组精确比对，研究人员可获得全基因组范围内某种修饰类型的特定组蛋白或转录因子与基因组DNA序列之间的关系，也可对多个样品进行差异比较。
应用方向：
ChIP 用来在空间上和时间上不同蛋白沿基因或基因组定位
- 转录因子和辅因子结合作用
- 复制因子和 DNA 修复蛋白
- 组蛋白修饰和变异组蛋白
技术优势：
- 物种范围广：细胞、动物组织、植物组织、细菌微生物多物种富集经验；
- 微量建库：只需5ng以上免疫沉淀后的DNA，即可展开测序分析；
- 方案灵活：根据不同的项目需求，选择不同的组蛋白修饰特异性抗体。
技术路线：
易基因提供全面的DNA与蛋白互作测序方案，详询易基因：0755-28317900。
参考文献：
Han D, Schaffner SH, Davies JP, Benton ML, Plate L, Nordman JT. BRWD3 promotes KDM5 degradation to maintain H3K4 methylation levels. Proc Natl Acad Sci U S A. 2023 Sep 26;120(39):e2305092120.
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