书接上回，我也是一个万万没想到啊，陈卫华，赵兴明老师的三代宏病毒组研究，居然让我追到续集了！

前一回中，利用三代单分子测序技术，科研团队成功构建了中国人肠道噬菌体目录（CHGV），提出二代结合三代混合组装的策略更有利于宏病毒组信息的挖掘:宿主基因组-微生物关联（mGWAS）新思路!

话说三代测序除了能够获得更多更完整的宏病毒基因组信息之外，还能有哪些“神奇魔力”呢？

近日，华中科技大学陈卫华和刘智、复旦大学赵兴明、欧洲分子生物学实验室Peer Bork及团队在Advanced Science(IF=15.000) 发表最新成果《Long-read sequencing reveals extensive DNA methylations in human gut Phagenome Contributed by Prevalently Phage-Encoded Methyltransferases》，该研究在之前研究的基础上，成功利用三代测序技术对104个粪便样本的8848个高质量宏样本噬菌体基因组的DNA甲基化模式开展研究。

在利用二代（illumina）加三代（PacBio CCS）宏基因组测序构建出一组代表人类肠道噬菌体组的中国人类肠道噬菌体目录（CHGV）后，研究人员筛选出完整度≥90%的8848个高质量噬菌体基因组进行基因组甲基化研究：发现其中97.60%的肠道噬菌体表现出甲基化（下图A-B-C），并且包含m4C和m6A两种类型的甲基化修饰(下图D)。此外，研究还鉴定出157个甲基化motifs，这其中包含两个新的motifs（下图E）。

图1  人肠道噬菌体基因组甲基化全景统计。

研究对不同生活史类型的噬菌体基因组的DNA甲基化模式进行了分析，发现它们与噬菌体的基因组特征及进化特征相关：m4C甲基化在CDS及Non-coding region的密度随着噬菌体烈性的增加而增加，而m6A则呈现相反趋势（下图A-B）——这说明不同类型的甲基化修饰在噬菌体中扮演着不同角色，可能与噬菌体的功能和生存状况有关。此外，研究还对具有各种功能的基因中观察到的差异甲基化模式进行统计（下图D），表明在肠道噬菌体中，功能上重要的基因更有可能被甲基化。噬菌体的分布广度和甲基化密度之间存在很强的正相关性（下图E），较高的甲基化密度对应着较高的噬菌体活力。

图2  CHGV-HQ基因组的DNA甲基化分布模式。

为阐明这些高频甲基化背后的机制，研究人员对这些甲基化的来源进行了研究——肠道噬菌体是否可以编码自己的DNA甲基转移酶（MTases），结果发现有超过1/3的噬菌体拥有DNA MTases基因（下图A-B），且MTases拷贝数的增加与较高的基因组甲基化密度、特定甲基化motif(下图D-E)及某些噬菌体群体的感染率升高(下图F)有关。此外，研究发现噬菌体的生活方式也与MTases的分布有关：温和型噬菌体中包含有更多的MTases基因，而在烈性噬菌体中则罕见MTases（图G-H）。

图3 噬菌体编码的MTases在肠道噬菌体中普遍存在

研究中比较了噬菌体MTases与宿主菌编码的MTases序列之间的相似性发现，两者蛋白质序列同源性极高（下图A）。基于此，研究者大胆提出假设：噬菌体与宿主菌之间应该存在基因交流（下图B），噬菌体可以利用自己编码的MTases来逃避细菌的防御机制。利用MTases的这种同源性，可用于预测样本中噬菌体-宿主菌对应关系，且具有较高的准确性（下图C-D-E）。这一结果揭示了噬菌体DNA甲基化在逃避宿主防御系统中的作用，也说明了噬菌体及细菌之间的基因交流对肠道微生物群落的影响。

图4 噬菌体-细菌MTases的高度同源性可用于高精度预测噬菌体-宿主菌关系

综上，不难发现，肠道噬菌体基因组甲基化现象普遍存在，甲基化水平与噬菌体生活史和烈性的相关性更有助于理解病毒基因组甲基化的功能，在肠道噬菌体逃避宿主防御系统中噬菌体基因组编码的MTase有重要贡献。同时，MTase基因在噬菌体和宿主菌基因组间的蛋白质序列同源性证实了噬菌体-宿主菌间的基因交流过程，也为噬菌体-宿主关系确认提供了高精准度的解决思路。

参考文献

Long-read sequencing reveals extensive DNA methylations in human gut Phagenome Contributed by Prevalently Phage-Encoded Methyltransferases. Advanced Science, 2023.