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环状 RNA（或 circRNA ）是一种单链 RNA，与线性 RNA 不同，形成一个共价闭合的连续环。在环状 RNA 中，RNA 分子中通常存在的 3’ 和 5’ 端已经连接在一起。这一特征赋予了环状 RNA 许多性质，其中许多性质直到最近才被发现。许多类型的环状 RNA 来自原本编码蛋白质的基因。一些环状 RNA 已经被证明能够编码蛋白质。一些类型的环状 RNA 也最近显示出作为基因调节因子的潜力。大多数环状 RNA 的生物学功能尚不清楚。由于环状 RNA 没有 5’ 或 3’ 端，能够抵抗外切核酸酶介导的降解，在细胞中可能比大多数线性 RNA 更稳定。环状 RNA 已经与一些疾病如癌症相关联。

mRNA，即 Messenger RNA，信使核糖核酸。

1. LNP cmRNA (Circle mRNA) 递送系统

Lipid nanoparticles，脂质纳米粒子，
Lipid nanoparticles (LNPs) are a non-viral gene delivery system that can carry both nucleic acids and proteins. LNPs are used to deliver RNA, protecting it from degradation in the bloodstream. They can also bind to specific receptors on cell membranes.
脂质纳米粒子（LNPs）是一种非病毒基因传递系统，可以携带核酸和蛋白质。 LNP 用于传递 RNA，保护其免于在血流中降解。还可以与细胞膜上的特定受体结合。

为了在细胞中适量表达蛋白质，必须将合成的 mRNA 安全高效地递送到靶细胞细胞质中，这也是 mRNA 药物研发面临的一大挑战。

有效的递送系统必须具有以下功能：

1. 结合 mRNA 形成复合物；
2. 促进细胞摄取；
3. 保护 mRNA 免受细胞内和细胞外核酸酶的侵蚀降解；
4. 将 mRNA 释放到细胞质中。

建立 化合物合成 研发平台，建立 阳离子化合物 库，与 LNP 递送效果动物体内评价体系，配方优化体系，拥有持续化合物合成和筛选能力。

伴随 mRNA 关键技术的进步，mRNA 药物或将展现出巨大优势和应用前景，成为人类对抗疾病的强大武器。

Circle RNA 成环框架

mRNA 疫苗因为快速高效安全的大范围应用，无疑成为生物医药皇冠上最耀眼的明珠。mRNA 技术也走进公众视野，得到社会各层面的重视。进入后疫情时代，mRNA 的应用领域不断被拓展，新的适应症需求体现了线性 mRNA 的各种不足。环状 mRNA 因为其无需加帽加尾的闭环结构，体内外更稳定，表达时间更长，制备工艺更简单，成本更优，有望成为线性 mRNA 的替代者，开启 mRNA 2.0 时代。

目前体外 RNA 环化策略主要 3 种：化学方法、连接酶方法（T4 RNA ligases）、核酶方法（group Ⅰ、group Ⅱ self-splicing introns）。连接酶和核酶方法最为常用。

免疫原性（Immunogenicity, [ˌɪmjʊnəʊdʒɪˈnɪsɪti]）是指某抗原或其表位能作用于T细胞、B细胞的抗原识别受体，进而诱导机体产生体液和/或细胞介导免疫应答的特性；此抗原则可称为免疫原（immunogen）。蛋白质具有最强的免疫原性，其次是多糖；而脂质与核酸一般并不能成为免疫原，常常要借由与蛋白质结合才能激活免疫应答反应。

I型内含子自剪接：MIT Daniel 研究组通过工程化改造鱼腥藻（Anabaena）I型内含子实现了体外长编码 RNA 的环化，在镁离子和 GTP 存在下，发生两次酯交换反应，形成环状 RNA。通过优化经典的鱼腥藻 PIE ，通过增加同源臂 (homology arm)、间隔序列 (spacer)，解决长编码 RNA 序列成环的难题，并且能够得到较好的成环效率。另外一方面，通过 HPLC 纯化策略以及 IRES 序列筛选增强了 circRNA 在细胞内蛋白表达的稳定性和效率。这种成环策略由于增加了间隔序列且外显子序列较长，所以需要在最终的环状 RNA 产物中额外引入 186 nt 碱基序列。

• GTP，即 Guanosine [ˈɡwɑːnəˌsiːn]-5’-triphosphate[traɪˈfɒsfeɪt]，嘌呤核苷三磷酸
• PIE，即 Permuted Intron-Exon[ˈeksɒn]，排列的内含子-外显子。
• HnRNA，即Heterogeneous nuclear Ribonucleic Acid，异质核的核糖核酸
• HPLC，即High Performance Liquid Chromatography，高效液相色谱
• IRES，即Internal Ribosome Entry Site，内部核糖体进入位点
• nt，nucleotides[ˈnjuːklɪətaɪdz]，即核苷酸。

内含子 (Intron) 和外显子 (Exon)：基因 DNA 分为编码区和非编码区，编码区包含外显子和内含子，一般非编码区具有基因表达的调控功能，如启动子在非编码区。编码区则转录为 mRNA 并最终翻译成蛋白质。外显子和内含子都被转录到 mRNA 前体 HnRNA 中，当 HnRNA 进行剪接变为成熟的 mRNA 时，内含子被切除，而外显子保留。实际上真正编码蛋白质的是外显子，而内含子则无编码功能。
内含子存在于DNA 中，在转录的过程中，DNA 上的内含子也会被转录到前体 RNA 中，但前体 RNA 上的内含子会在 RNA 离开细胞核进行翻译前被切除。

II型内含子自剪接：II型内含子（group II intron）存在于原生生物、真菌以及细菌基因组中。在体内 II 型内含子，可通过两步连续的转酯反应，从前体RNA中自剪接，并连接两侧外显子，许多 II 型内含子的剪接反应是由蛋白质辅助完成的。同时 II 型内含子也被证明可以在体外通过自我催化发生剪切反应。

T4 DNA/RNA ligase (连接酶)：T4 DNA/RNA ligase 体外连接成环的方法可以避免外源序列引入导致的免疫原性。但是，T4 连接酶相对低效的连接效率和需要借助 DNA 夹板序列辅助的成环方法，使其很难实现工业化制备；该方法也发展了借助内源性的夹板链实现 RNA 的环化。

参考：

• Nucleotides
• IRES - Internal Ribosome Entry Site
• Circular RNA