GEO生信数据挖掘（八）富集分析（GO 、KEGG、 GSEA 打包带走）

第六节，我们使用结核病基因数据，做了一个数据预处理的实操案例。例子中结核类型，包括结核，潜隐进展，对照和潜隐，四个类别。第七节延续上个数据，进行了差异分析。本节对差异基因进行富集分析。

数据展示

GO富集分析 -对基因名称映射基因ID

GO富集分析 -从org.Hs.eg.db库中去匹配基因

KEGG富集分析（不详细讲了看注释）

GSEA 富集分析

更多复杂的图（关联网络图、八卦图、弦图）

数据展示

差异基因计算完毕的指标如下图所示

差异基因筛选后表达矩阵

GO富集分析 -对基因名称映射基因ID

加载数据


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#+&&&&&&&&&&&&&&&&&&加载数据&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
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load( "DEG_TB_LTBI_step13.Rdata")
#++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++
#+&&&&&&&&&&&&&&&&&&加载数据&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
#&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&


library(clusterProfiler)
library(org.Hs.eg.db)

#增加基因名
all_diff$SYMBOL=rownames(all_diff)


#基因名称转换注释
gene_ids_DEG_TB_LTBI = bitr(geneID = rownames(dataset_TB_LTBI_DEG),fromType="SYMBOL",toType = c("ENTREZID","ENSEMBL","SYMBOL"),OrgDb = 'org.Hs.eg.db',drop =TRUE)

#合并 增加logFC 为后续GSEA富集分析所需数据准备
gene_ids_DEG_TB_LTBI <- merge(gene_ids_DEG_TB_LTBI,all_diff,by="SYMBOL")

#观察
dim(gene_ids_DEG_TB_LTBI)
head(gene_ids_DEG_TB_LTBI)

#获取基因ID ENSEMBL
gene_ENSEMBL <- gene_ids_DEG_TB_LTBI$ENSEMBL
gene_ENTREZID <- gene_ids_DEG_TB_LTBI$ENTREZID
gene_SYMBOL<- gene_ids_DEG_TB_LTBI$SYMBOL

经过映射，2813个差异基因得到2551个基因ID,下图为三种不同形式的基因名称，富集分析时，按需进行转换。

GO富集分析 -从org.Hs.eg.db库中去匹配基因

#Go富集分析，从库中去匹配
go <- enrichGO(gene_SYMBOL,OrgDb = org.Hs.eg.db, ont='ALL',pAdjustMethod = 'BH',pvalueCutoff = 0.05, qvalueCutoff = 0.2,keyType = 'SYMBOL')#进行GO富集，确定P值与Q值得卡值并使用BH方法对值进行调整。
#查看富集结果
dim(go)
#导出GO富集的结果
write.csv(go,file="go1.csv")

绘制气泡图

#绘制气泡图
pdf(file="15aGO富集分析step15.pdf", width = 9, height = 6)
dotplot(go,showCategory=20,label_format = 80)#气泡图
 dev.off()

三种不同类别的合并的气泡图（#CC细胞组件，MF分子功能，BP生物学过程）

pdf(file="15bGO富集分析三组step15.pdf", width = 9, height = 6)

#CC细胞组件，MF分子功能，BP生物学过程
goCC <- enrichGO(gene = gene_ENTREZID,  #基因列表(转换的ID)
               keyType = "ENTREZID",  #指定的基因ID类型，默认为ENTREZID
               OrgDb=org.Hs.eg.db,  #物种对应的org包
               ont = "CC",   #CC细胞组件，MF分子功能，BP生物学过程
               pvalueCutoff = 0.05,  #p值阈值
               pAdjustMethod = "fdr",  #多重假设检验校正方式
               minGSSize = 1,   #注释的最小基因集，默认为10
               maxGSSize = 500,  #注释的最大基因集，默认为500
               qvalueCutoff = 0.2,  #q值阈值
               readable = TRUE)  #基因ID转换为基因名

goBP <- enrichGO(gene_ENTREZID,OrgDb = org.Hs.eg.db, ont='BP',pAdjustMethod = 'BH',pvalueCutoff = 0.05, qvalueCutoff = 0.2,keyType = 'ENTREZID')

goMF <- enrichGO(gene_ENTREZID,OrgDb = org.Hs.eg.db, ont='MF',pAdjustMethod = 'BH',pvalueCutoff = 0.05, qvalueCutoff = 0.2,keyType = 'ENTREZID')
#通过ggplot2将BP、MF、CC途径的富集结果挑选前8条绘制在一张图上
barplot(go,label_format=100, split="ONTOLOGY")+ facet_grid(ONTOLOGY~.,scale="free")

dev.off()

KEGG富集分析（不详细讲了看注释）



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#+========KEGG富集分析 气泡图step16===================
#+==========================================
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#KEGG富集分析
pdf(file="16KEGG富集分析step16.pdf", width = 9, height = 6)
kegg<- enrichKEGG(gene = gene_ENTREZID,   #基因列表(ENTREZID ID: 54490,51144,31,3906) 
                  organism = "hsa",  #物种
                  keyType = "kegg",  #指定的基因ID类型，默认为kegg
                  minGSSize = 3, 
                  maxGSSize = 500,
                  pvalueCutoff = 0.05,  
                  pAdjustMethod = "fdr", # pAdjustMethod = 'BH'
                  qvalueCutoff = 0.02)
#观察
dim(kegg)
#绘制气泡图
dotplot(kegg)
dev.off()

#kegg 增加可读性，对基因ID 转基因名
kegg_enrich_results <- DOSE::setReadable(kegg, 
                                         OrgDb="org.Hs.eg.db", 
                                         keyType='ENTREZID') #ENTREZID to gene Symbol

#保存kegg结果
write.csv(kegg_enrich_results@result,'KEGG_gene_up_enrichresults.csv') 
#save(kegg_enrich_results, file ='KEGG_gene_up_enrichresults.Rdata')


##查看与选择所需通路
kegg_enrich_results@result$Description[1:10] #查看前10通路

###选择所需通路的ID号
i=1
select_pathway <- kegg_enrich_results@result$ID[i] #选择所需通路的ID号




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#+&&&&&&&&&&&&&&&&&&数据保存&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
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save(gene_ids_DEG_TB_LTBI,go,keggfile ="15_gene_ids_DEG_TB_LTBI.Rdata")
#++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++
#+&&&&&&&&&&&&&&&&&&数据保存&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
#&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&

GSEA 富集分析


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#+========GSEA 富集分析 气泡图step17===================
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# GSEA 分析
#需要把多个方法取并集
#该方法的输入需要基因和 logFC 排序后的结果
#不同方法 相同基因的的logFC值不一样，直接保留第一个重复基因


library(stringr)



## 去重  #去除NA值
dim(gene_ids_DEG_TB_LTBI)
colnames(gene_ids_DEG_TB_LTBI)

gene_list_df = gene_ids_DEG_TB_LTBI[,c('ENTREZID','logFC')]
gene_list_df_na <- na.omit(gene_list_df)

gene_ids_TB_LTBI_distinct <- dplyr::distinct(gene_list_df_na,ENTREZID,.keep_all=TRUE) 

dim(gene_ids_TB_LTBI_distinct)
gene_list=gene_ids_TB_LTBI_distinct$logFC   #提取logFC列
names(gene_list)=gene_ids_TB_LTBI_distinct$ENTREZID             #加上ENTREZID
gene_list_gsea = sort(gene_list, decreasing = T)  #降序排列





gsea_KEGG <- gseKEGG(gene_list_gsea,
                     organism = "hsa",
                     keyType = "kegg")

gsea_KEGG_d <- as.data.frame(gsea_KEGG)

gsea_KEGG_d
#path 为需要展示的pathway id，这里展示的是enrichment score最高的4条通路


t_index=order(gsea_KEGG_d$enrichmentScore,decreasing = T)
path=rownames(gsea_KEGG[t_index,]) #选择展示的 pathwayrownames(gsea_KEGG[t_index,]) [1:4]

#作图 
pdf(file="17GSEA富集分析step17.pdf", width = 9, height = 6)
gseaplot2(gsea_KEGG,
          path, 
          subplots = 1:2, #展示前2个图
          pvalue_table = T, #显示p值
          title = "Olfactory transduction",  #设置title
          base_size = 10, #字体大小
          color="red") #线条颜色可选
dev.off()


#&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
#+&&&&&&&&&&&&&&&&&&数据保存&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
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save(gene_ids_DEG_TB_LTBI,go,kegg,gene_list_gsea,gsea_KEGG,file ="17_gene_ids_DEG_TB_LTBI.Rdata")
#++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++
#+&&&&&&&&&&&&&&&&&&数据保存&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
#&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&

更多复杂的图（关联网络图、八卦图、弦图）

参考最全的GO, KEGG, GSEA分析教程(R),你要的高端可视化都在这啦！[包含富集圈图] - 糖糖家的老张的文章 - 知乎 https://zhuanlan.zhihu.com/p/377356510

原文链接：https://blog.csdn.net/qq_50898257/article/details/120588222

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#+========富集分析 更多的图step18===================
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library(clusterProfiler)
library(enrichplot)
#+富集基因与所在功能集/通路集的关联网络图：
enrichplot::cnetplot(go,circular=FALSE,colorEdge = TRUE)#基因-通路关联网络图
enrichplot::cnetplot(kegg,circular=FALSE,colorEdge = TRUE)#circluar为指定是否环化，基因过多时建议设置为FALSE

GO2 <- pairwise_termsim(go)
KEGG2 <- pairwise_termsim(kegg)
enrichplot::emapplot(GO2,showCategory = 50, color = "p.adjust", layout = "kk")#通路间关联网络图
enrichplot::emapplot(KEGG2,showCategory =50, color = "p.adjust", layout = "kk")


write.table(kegg$ID, file = "KEGG_IDs.txt", #将所有KEGG富集到的通路写入本地文件查看
            append = FALSE, quote = TRUE, sep = " ",
            eol = "\n", na = "NA", dec = ".", row.names = TRUE,
            col.names = TRUE, qmethod = c("escape", "double"),
            fileEncoding = "")
#打印几条通路名称看看
kegg$ID[1:3]
#打开浏览器观察通路
browseKEGG(kegg,"hsa04660")#选择其中的hsa05166通路进行展示




#富集弦图
genedata<-data.frame(ID=gene_ids_DEG_TB_LTBI$SYMBOL  ,logFC=gene_ids_DEG_TB_LTBI$logFC)
write.table(go$ONTOLOGY, file = "GO_ONTOLOGYs.txt", #将所有GO富集到的基因集所对应的类型写入本地文件从而得到BP/CC/MF各自的起始位置如我的数据里是1，2103，2410
            append = FALSE, quote = TRUE, sep = " ",
            eol = "\n", na = "NA", dec = ".", row.names = TRUE,
            col.names = TRUE, qmethod = c("escape", "double"),
            fileEncoding = "")

'''
根据计算出的go 文件数量，调整
'''
GOplotIn_BP<-go[1:178,c(2,3,7,9)] #提取GO富集BP的前10行,提取ID,Description,p.adjust,GeneID四列
GOplotIn_CC<-go[179:194,c(2,3,7,9)]#提取GO富集CC的前10行,提取ID,Description,p.adjust,GeneID四列
GOplotIn_MF<-go[195:209,c(2,3,7,9)]#提取GO富集MF的前10行,提取ID,Description,p.adjust,GeneID四列

library(stringr)
GOplotIn_BP$geneID <-str_replace_all(GOplotIn_BP$geneID,'/',',') #把GeneID列中的’/’替换成‘,’
GOplotIn_CC$geneID <-str_replace_all(GOplotIn_CC$geneID,'/',',')
GOplotIn_MF$geneID <-str_replace_all(GOplotIn_MF$geneID,'/',',')
names(GOplotIn_BP)<-c('ID','Term','adj_pval','Genes')#修改列名,后面弦图绘制的时候需要这样的格式
names(GOplotIn_CC)<-c('ID','Term','adj_pval','Genes')
names(GOplotIn_MF)<-c('ID','Term','adj_pval','Genes')
GOplotIn_BP$Category = "BP"#分类信息
GOplotIn_CC$Category = "CC"
GOplotIn_MF$Category = "MF"

BiocManager::install('GOplot')
library(GOplot)
circ_BP<-GOplot::circle_dat(GOplotIn_BP,genedata) #GOplot导入数据格式整理
circ_CC<-GOplot::circle_dat(GOplotIn_CC,genedata) 
circ_MF<-GOplot::circle_dat(GOplotIn_MF,genedata) 

chord_BP<-chord_dat(data = circ_BP,genes = genedata) #生成含有选定基因的数据框
chord_CC<-chord_dat(data = circ_CC,genes = genedata) 
chord_MF<-chord_dat(data = circ_MF,genes = genedata) 
'''
> chord_CC<-chord_dat(data = circ_CC,genes = genedata) 
Error in `[<-`(`*tmp*`, g, p, value = ifelse(M[g] %in% sub2$genes, 1,  : 
  subscript out of bounds
  我去检查了go和genelist的数据结构发现，genelist里的gene用的是gene名，而go里的基因用的是基因ID，不一样了，所以跑不出结果，所以我把genelist的gene换成了基因ID，就能跑出来了。

作者：ff的小世界勿扰
链接：https://www.jianshu.com/p/ee4012fd253f
来源：简书
著作权归作者所有。商业转载请联系作者获得授权，非商业转载请注明出处。
'''

#可以画 数量太多了
GOChord(data = chord_BP,#弦图
        title = 'GO-Biological Process',space = 0.01,#GO Term间距
        limit = c(1,1),gene.order = 'logFC',gene.space = 0.25,gene.size = 5,
        lfc.col = c('red','white','blue'), #上下调基因颜色
        process.label = 10) #GO Term字体大小
GOChord(data = chord_CC,title = 'GO-Cellular Component',space = 0.01,
        limit = c(1,1),gene.order = 'logFC',gene.space = 0.25,gene.size = 5,
        lfc.col = c('red','white','blue'), 
        process.label = 10) 
GOChord(data = chord_MF,title = 'GO-Mollecular Function',space = 0.01,
        limit = c(1,1),gene.order = 'logFC',gene.space = 0.25,gene.size = 5,
        lfc.col = c('red','white','blue'), 
        process.label = 10)
'''
Warning messages:
1: Using size for a discrete variable is not advised. 
2: Removed 15 rows containing missing values (`geom_point()`). 
'''

富集分析完毕！

回顾我们用到方法，差异分析后进行富集分析，理论基础实际上就是简单的找不同，分析。

实际应用种，由于基因之间存在关联，另一套分析理论考虑的是基因之间的相互作用，下节，我们来看非常火的WGCNA 共表达加权网络进行基因分析。