miRNA测序数据生信分析——第四讲，未知物种的生信分析实例

再次强调：这里未知物种，是指进行miRNA测序的物种在miRBase、miRDB、miRTarbase数据库都不存在miRNA信息。而不是不知道进行miRNA测序的物种

1. 下载测序数据

和博文（miRNA测序数据生信分析——第三讲，已知物种的生信分析实例）中的测序数据一样。假设这个数据的物种是Oecanthus indicus。
SRA号：DRR463940 单端测序 测序类型：miRNA-seq 文件DRR463940.fastq

2. 原始数据质控——软件fastqc

3. 注释tRNA和rRNA，使用Rfam数据库——软件blast，Rfam_statistics.py脚本

4. 注释miRNA，包括种类，序列及定量，靶基因和绘图

测序物种Oecanthus indicus（Oin）。该物种在miRBase、miRDB、miRTarbase数据库都不存在miRNA信息。

4.1 鉴定，使用miRBase数据库——软件blast

cd /home/zhaohuiyao/miRNA_seq/DRR463940/02miRNA/unknown/01miRBase
#查询物种Oecanthus indicus是否在数据库miRBase中
grep “Oecanthus indicus” /home/zhaohuiyao/Database/miRBase/organisms.txt #没有返回

#自己编辑三个字符简写为：oin
/home/zhaohuiyao/Biosoft/general/ncbi-blast-2.10.0+/bin/makeblastdb -in /home/zhaohuiyao/Database/miRBase/mature.fa -dbtype nucl -out /home/zhaohuiyao/Database/miRBase/mature
#只保留一个比对结果
/home/zhaohuiyao/Biosoft/general/ncbi-blast-2.10.0+/bin/blastn -task blastn-short -db /home/zhaohuiyao/Database/miRBase/mature -query …/…/00Rawdata/DRR463940.fasta -out DRR463940_miRBase.annotations -outfmt 6 -evalue 1e-5 -num_alignments 1
head DRR463940_miRBase.annotations

#统计
wc -l ./DRR463940_miRBase.annotations #63113条比对结果（63113/311289=20.27%）
cut -f 2 ./DRR463940_miRBase.annotations | awk ‘{name=substr($1,5,length($1)); print name}’ | sort | uniq | wc -l #420种miRNA（不关注物种，只关注miRNA种类）

4.2 定量和miRNA序列提取

miRNA序列提取：
步骤一：提取一种miRNA（不关注物种）对应的测序Reads序列名称，并在测序Reads中进行序列提取，拿到该miRNA的所有可能序列
步骤二：对所有可能序列进行多序列比对（MATTF）
步骤三：依据MAFFT比对结果，提取一致性序列，该一致性序列为该测序物种miRNA序列
步骤四：整合所有miRNA序列
miRNA序列定量：
在运行上面步骤一时，会生成序列定量文件

步骤一：提取一种miRNA（不关注物种）对应的测序Reads序列名称，并在测序Reads中进行序列提取，拿到该miRNA的可能序列。
cd /home/zhaohuiyao/miRNA_seq/DRR463940/02miRNA/unknown/02Sequence_Quantity
python ./miRBase_sequence_unknown.py -i …/01miRBase/DRR463940_miRBase.annotations -data /home/zhaohuiyao/miRNA_seq/DRR463940/00Rawdata/DRR463940.fasta -s oin -o ./

#miRNA定量结果

#某一miRNA对应的是所有测序Reads序列

步骤二：对所有可能序列进行多序列比对（MATTF）
#安装MAFFT
官网下载最新安装包：https://mafft.cbrc.jp/alignment/software/
cd /home/zhaohuiyao/Biosoft/general
wget https://mafft.cbrc.jp/alignment/software/mafft-7.505-with-extensions-src.tgz
tar -zxvf ./mafft-7.505-with-extensions-src.tgz
cd mafft-7.505-with-extensions/core/
#编辑文件，vim Makefile。修改第一行内容，PREFIX = /usr/local  PREFIX = /home/zhaohuiyao/Biosoft/general/mafft-7.505-with-extensions
make clean
make
make install
#可执行文件：/home/zhaohuiyao/Biosoft/general/mafft-7.505-with-extensions/bin/mafft

cd /home/zhaohuiyao/miRNA_seq/DRR463940/02miRNA/unknown/02Sequence_Quantity
mkdir MAFFT && cd MAFFT/
#编辑脚本mafft_run.sh
/bin/bash ./mafft_run.sh
#每个miRNA序列文件对应一个.mafft结果文件

步骤三：依据MAFFT比对结果，提取一致性序列，该一致性序列为本物种miRNA序列
cd /home/zhaohuiyao/miRNA_seq/DRR463940/02miRNA/unknown/02Sequence_Quantity/MAFFT/
mkdir consensus && cd consensus/
#编辑脚本consensus_run.sh以及consensus_seq.py
一致性序列的标准：依据多序列比对结果，统计每一个位置碱基的频次。频次最高的碱基为该位置碱基。
其中可能涉及的问题：①当该位置频次最高的是“-”字符时，忽略该位置。②当该位置频次最高的字符出现多个时，涉及到简并碱基的问题，这次暂不考虑，随机选择一种。

/bin/bash ./consensus_run.sh
#每个.mafft结果文件对应一个.concensus文件

步骤四：整合所有miRNA序列
cd /home/zhaohuiyao/miRNA_seq/DRR463940/02miRNA/unknown/02Sequence_Quantity
cat ./MAFFT/consensus/oin-* > DRR463940_miRBase.annotations.fa

4.3 miRNA靶基因，使用miRanda和TargetScan软件进行预测

#三个子目录miRanda/、TargetScan/和Total/
#两个软件的运行均需要准备两个文件。miRNA序列文件和mRNA序列文件。
miRNA序列文件：①成熟的miRNA序列，长度20-24nt；②种子序列，成熟miRNA 5’端的第2-8个核苷酸。
mRNA序列文件：①可以包括其他ncRNA序列（例如lncRNA也能与miRNA靶向结合）；②可以是完整的mRNA序列，也可以是mRNA的仅3`UTR序列；③可以一个基因对应一个mRNA序列，也可以多个（最后会整合到靶基因水平。但是需要提供mRNA—Gene关系文件）

#准备文件
#miRNA序列文件：上面4.2拿到的miRNA序列文件
#mRNA序列文件：这个文件包括了其他ncRNA序列，完整mRNA序列，一个基因对应多个mRNA序列。
#mRNA—Gene关系文件

cd /home/zhaohuiyao/miRNA_seq/DRR463940/02miRNA/unknown/03Target/
#mRNA序列文件
wget https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/000/001/405/GCF_000001405.40_GRCh38.p14/GCF_000001405.40_GRCh38.p14_rna.fna.gz
gunzip ./GCF_000001405.40_GRCh38.p14_rna.fna.gz
#mRNA—Gene关系文件
grep ">" GCF_000001405.40_GRCh38.p14_rna.fna | awk -v OFS="\t" '{split($0,arr," "); name=substr(arr[1],2); split($0,arr1,")"); split(arr1[1],arr2,"("); print name,arr2[2]}' > mrna_gene.info

#将fasta进行多行转单行
/home/zhaohuiyao/Biosoft/seqkit seq -i -w 0 GCF_000001405.40_GRCh38.p14_rna.fna > GCF_000001405.40_GRCh38.p14_rna.fna.tmp
rm GCF_000001405.40_GRCh38.p14_rna.fna
mv GCF_000001405.40_GRCh38.p14_rna.fna.tmp GCF_000001405.40_GRCh38.p14_rna.fna 

4.3.1 miRanda软件

#安装软件miRanda
cd /home/zhaohuiyao/Biosoft/general
wget http://cbio.mskcc.org/microrna_data/miRanda-aug2010.tar.gz
tar -zxvf ./miRanda-aug2010.tar.gz
cd miRanda-3.3a/
./configure --prefix=/home/zhaohuiyao/Biosoft/general/miRanda-3.3a
make
make install
#可执行文件：/home/zhaohuiyao/Biosoft/general/miRanda-3.3a/bin/miranda

cd /home/zhaohuiyao/miRNA_seq/DRR463940/02miRNA/unknown/03Target/miRanda
ln -s …/GCF_000001405.40_GRCh38.p14_rna.fna oin_mrna.fasta
ln -s …/mrna_gene.info oin_gene_mrna.info.txt
/home/zhaohuiyao/Biosoft/general/miRanda-3.3a/bin/miranda …/…/02Sequence_Quantity/DRR463940_miRBase.annotations.fa oin_mrna.fasta -quiet -out DRR463940_miRBase.annotations.miRanda.original
#参数-quiet：表示不输出没有发生靶向的miRNA-mRNA关系
#结果文件DRR463940_miRBase.annotations.miRanda.original，这个文件中只有以">>"开头的行，才是预测的miRNA-靶mRNA的信息行
grep “>>” DRR463940_miRBase.annotations.miRanda.original > DRR463940_miRBase.annotations.miRanda.tmp
#结合mRNA—Gene的关系文件（oin_gene_mrna.info.txt），获得mRNA-靶基因关系文件
python3 ./miRanda_Target.py -i ./DRR463940_miRBase.annotations.miRanda.tmp -db ./oin_gene_mrna.info.txt -o ./
#结果文件DRR463940_miRBase.annotations.miRanda

4.3.2 TargetScan软件

#安装软件TargetScan
cd /home/zhaohuiyao/Biosoft/general
mkdir targetscan_50 && cd targetscan_50/
wget https://www.targetscan.org/vert_50/vert_50_data_download/targetscan_50.zip
unzip ./targetscan_50.zip && rm ./targetscan_50.zip
#可执行文件：/home/zhaohuiyao/Biosoft/general/targetscan_50/targetscan_50.pl

cd /home/zhaohuiyao/miRNA_seq/DRR463940/02miRNA/unknown/03Target/TargetScan
ln -s …/GCF_000001405.40_GRCh38.p14_rna.fna oin_mrna.fasta
ln -s …/mrna_gene.info oin_gene_mrna.info.txt

#TargetScan对输入的文件格式有要求。请依据要求对miRDB用到的文件进行修改，得到新的输入文件DRR463940_miRBase.annotations.fa.TargetScan和oin_mrna.fasta.TargetScan
#miRNA只需要种子序列（miRNA 5’端的第2~8个核苷酸），物种号：NCBI的Taxonomy数据库中查看1982312
awk ‘{if($0~/^>/){printf “%s\t”, substr($0,2) } else { printf “%s\t%s\n”, substr($0,2,7),“1982312”}}’ …/…/02Sequence_Quantity/DRR463940_miRBase.annotations.fa > RR463940_miRBase.annotations.fa.TargetScan

awk ‘{if($0~/^>/){printf “%s\t”, substr($0,2) } else { printf “%s\t%s\n”, “1982312”,$0}}’ oin_mrna.fasta > oin_mrna.fasta.TargetScan

perl /home/zhaohuiyao/Biosoft/general/targetscan_50/targetscan_50.pl DRR463940_miRBase.annotations.fa.TargetScan oin_mrna.fasta.TargetScan DRR463940_miRBase.annotations.TargetScan.original
#结合mRNA—Gene的关系文件（oin_gene_mrna.info.txt），获得mRNA-靶基因关系文件
python ./TargetScan_Target.py -i ./DRR463940_miRBase.annotations.TargetScan.original -db ./oin_gene_mrna.info.txt -o ./
#结果文件DRR463940_miRBase.annotations.TargetScan

4.3.3 整合两个软件预测结果——脚本Total_Target.py

#取并集，获得最终miRNA-Gene关系文件
cd /home/zhaohuiyao/miRNA_seq/DRR463940/02miRNA/unknown/03Target/Total
python ./Total_Target.py -db1 …/miRanda/DRR463940_miRBase.annotations.miRanda -db2 …/TargetScan/DRR463940_miRBase.annotations.TargetScan -o ./
#结果文件DRR463940_miRBase.annotations.target

4.4 绘制miRNA-靶基因互作图——软件Cytoscape

5. 总结

以上就是针对未知物种的miRNA分析。与已知物种的分析之间存在重叠，重点是两个预测软件miRanda和TargetScan的使用。上面步骤中涉及了很多脚本，但都是很简单的文件内容提取比对。