细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）蛋白家族在细胞周期进程（如CDK1/2/4/6）和RNA转录（如CDK7/8/9/11）的调控中起着不可或缺的作用。由于染色体区域易位或基因扩增导致的CDKs表达失调与肿瘤发生有关。在淋巴瘤细胞中，如何通过ATAC-seq和ChIP-seq揭示CDK9抑制诱导表观遗传重编程？看看今天带来的这个文章。
发表单位：美国希望之城国家医疗中心
期 刊 ：Molecular Cancer（IF:37.3）
发表日期：2023年3月30日
研究技术：ATAC-seq、ChIP-seq
2023年3月，美国希望之城国家医疗中心的研究团队在Molecular Cancer期刊(IF=37.3)上发表了题为“CDK9 inhibition induces epigenetic reprogramming revealing strategies to circumvent resistance in lymphoma”的文章。研究人员通过ATAC-Seq和ChIP-Seq技术，揭示了在淋巴瘤细胞中CDK9抑制剂（CDK9i）通过染色质可及性的双向改变诱导表观遗传重塑，抑制启动子激活，并导致超级增强子景观的持续重编程，并且发现超级增强子驱动的选择癌基因的恢复可能有助于对CDK9i的抗性。
01 研究背景
弥漫性大B细胞淋巴瘤（Difuse large B-cell lymphoma，DLBCL）表现出显著的遗传异质性，这有助于药物抗药性，需要开发新的治疗方法。由于染色体区域易位或基因扩增导致的CDKs表达失调与肿瘤发生有关，CDK的药理抑制剂在DLBCL中显示出临床前活性，但许多药物在临床开发中陷入停滞。在这项研究中，作者的目的是通过ATAC-Seq和ChIP-Seq技术探究CDK9的选择性抑制剂对淋巴瘤细胞表观遗传重编程的影响，从而揭示其限制DLBCL细胞的生长的机制。
02 研究思路
03 研究结果
1. CDK9抑制剂AZD4573处理可抑制DLBCL细胞系的细胞增殖，诱导细胞凋亡
首先作者在体外用CDK9抑制剂AZD4573处理DLBCL细胞系（U-2932，VAL，OCI-LY3）后，观察到RNA聚合酶II（RNAPII）Ser2（CDK9靶位点）磷酸化的时间依赖性降低，还伴随着Mcl-1和MYC蛋白水平的下调（图1.A）。然后作者又用MTT分解比色法和Annexin-V 染色法检测AZD4573处理48h后9个DLBCL细胞系的增殖和凋亡情况，结果显示AZD4573能有效抑制淋巴瘤细胞的增殖和诱导凋亡（图1.B-D）。
图1.CDK9抑制剂AZD4573抑制DLBCL细胞系的细胞增殖，诱导细胞凋亡
2. CDK9抑制可瞬时抑制癌蛋白的表达。
为了了解AZD4573如何影响关键基因的表达以促进生长抑制，作者接下来通过LC/MS鉴定了AZD4573处理3h后DLBCL细胞系（VAL，OCI-LY3）蛋白水平的变化。结果显示，OCI-LY3和VAL细胞中分别有70个蛋白和113个蛋白不同表达（图2.A），作者鉴定了两种细胞系共有的83个表达下调和10个表达上调的蛋白（图2.B）。WB的结果显示，除了公认的CDK9抑制剂的靶点Mcl-1外，AZD4573治疗还可导致几种原癌蛋白的丰度降低，包括MYC、JunB和Pim-3（图2.C），对蛋白质组数据进行IPA分析，发现与RNAPII组装相关的信号通路以及PI3K-AKT信号通路和衰老途径在AZD4573处理的淋巴瘤细胞中表现出富集（图2.D）。接下来作者通过qPCR检测发现，AZD4573能有效抑制MYC、BCL2L1、IRF8、CXCR4以及MCL1的转录，持续时间可达8h，随后这些基因的转录又得到恢复（图2.E）。这些表明CDK9抑制诱导转录组和蛋白质组的快速变化。
图2.CDK9抑制可瞬时抑制癌蛋白的表达
3. CDK9抑制调节启动子和增强子结构
为了确定CDK9抑制后表观基因组的变化是否会导致转录失调，作者首先使用ATAC-Seq来评估使用CDK9抑制剂后的表观遗传景观。作者观察到在AZD4573处理3h和8h时，DLBCL细胞系中的差异peak逐渐增加（图3.A），发现在染色质可及性降低的区域CCCTC结合因子(CTCF)及其同源物的motif富集（图3.B）。
接下来作者研究了CDK9抑制如何调节增强子/启动子结构。通过对具有H3K4me3和H3K27ac标志物的组蛋白进行ChIP-Seq，分析发现使用AZD4573短期处理DLBCL细胞8h后，启动子区域的H3K4me3信号富集减少，启动子H3K27ac信号在VAL细胞中同样丢失，但在OCI-LY3细胞中没有（图3.C）。然后，作者研究了CDK9抑制在超级增强子（SE）体系结构上的特性，发现在VAL细胞中SEs占4.7%，在OCI-LY3细胞中SEs占5.4%（图3.D），另外DLBCL细胞在解除药物抑制后仍表现出持续的SE重编程（图3.E）。这些结果表明CDK9抑制诱导染色质可及性的广泛变化，抑制启动子激活并导致持续的SE重编程。
图3.CDK9抑制重新编程启动子和增强子景观
4. CDK9抑制增加了BRD4与染色质的结合
BRD4是SE相关基因的正调控因子，该基因与超乙酰化组蛋白结合以招募CDK9，为了在基因组上进行定位，作者对BRD4和RNAPII进行了ChIP-Seq检测。用AZD4573处理淋巴瘤细胞8h，然后进行洗脱，发现BRD4和RNAPII信号在启动子区域迅速富集（图4.A），而且与单独的实验化合物相比，同时持续靶向BRD4和CDK9显著减弱了DLBCL细胞的增殖（图4.B）。接下来，作者为了确定BRD4是否对“恢复基因”的转录是必要的，发现持续暴露在AZD4573和BET溴域抑制剂JQ1，DLBCL细胞中MYC、BCL2L1和IRF8 mRNA的转录就消除了（图4.C）。这些结果表明，虽然抑制CDK9确实诱导了BRD4与染色质的结合，但BRD4不太可能单独负责致癌基因的转录恢复，因为当CDK9和BRD4都被靶向时，仍然可以观察到恢复。
图4.BRD4增强转录恢复
5. 中介复合物调节对CDK9抑制的反应
作者为了进一步确定控制细胞对CDK9i的长期反应的基因和途径，为此进行了全基因组功能缺失的CRISPR-cas9文库筛选试验。结果显示MED4和AKT1以及CCNYL1和MED14分别是SU-DHL-10和U-2932细胞中缺失最多的sgRNAs，表明这些基因的敲除使细胞对CDK9抑制敏感（图5.A），富集分析显示，核糖体、剪接体、线粒体基质、类核和中介复合物的丢失使DLBCL细胞对CDK9抑制敏感（图5.B,C），与此一致的是，sgRNA介导的中介复合物亚基MED12基因敲除使DLBCL细胞对CDK9抑制敏感（图5.D）。
图5.中介复合物调节对CDK9i的反应
6. 克服对CDK9抑制剂耐药性的策略
前面的研究发现CDK9抑制后PIM激酶的mRNA和蛋白的恢复，另外CRISPR-cas9文库筛选发现AKT与对CDK9抑制剂的抗性有关，PI3K-AKT是人类恶性肿瘤中最常见的激活通路。因此作者将AZD4573与PIM激酶或PI3K抑制剂联合使用，这两种药物在体外均能抑制DLBCL和原代淋巴瘤细胞的增殖和诱导其凋亡（图6.A-D），并能延缓DLBCL体内移植小鼠的肿瘤进展和延长其存活时间（图6.E,F）。
图6.克服对CDK9i抗性的联合策略
04 研究结果
在这里，作者发现，CDK9抑制导致转录组和蛋白质组的快速变化，多种癌蛋白（如MYC、Mcl-1、JunB、PIM3）下调，磷酸肌苷-3激酶（PI3K）下调和衰老途径解除。在RNAPII暂停导致的初始转录抑制后，观察到一些致癌基因的转录恢复，包括MYC和PIM3。ATAC-Seq和ChIP-Seq实验表明，CDK9i诱导了染色质可及性的双向改变的表观遗传重构，抑制了启动子的激活，并导致了超级增强子景观的持续重编程。CRISPR文库筛选表明，中介复合物中的超级增强子相关基因以及AKT1对CDK9i具有抗性，对CDK9i的耐药性可以通过破坏超级增强子相关蛋白(BRD4，中介复合体)或靶向PIM和PI3K/ATK通路来规避。本研究的发现对这类药物的临床开发具有一定的指导意义。
原文链接：
https://molecular-cancer.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12943-023-01762-6
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