越来越多的证据表明，铁死亡参与了帕金森病（PD）的进展。本研究旨在探讨铁死亡相关基因（FRGs）、免疫浸润和免疫检查点基因（ICGs）在帕金森病发病和发展过程中的作用。
图1 流程图
1. 识别关键的 WGCNA 模块和 DEGs
聚类分析后，没有样本被剔除。基于 GSE18838 数据集构建了 WGCNA 网络，以确定与 PD 相关的有意义的基因模块。选择软阈值功率为 12，无标度拓扑拟合指数 R^2 达到 0.84，平均连接度为 18.10，表明无标度网络已经建立（图 2A，B）。通过动态树切割法确定共表达基因模块，合并相似模块后，根据 MEDissThres = 0.25 进一步筛选出关键模块（图 2C，D）。然后作者分析了关键模块与临床表型之间的关系，并显示了关键模块中所有基因的热图（图 2E，F）。在分析的10个模块中，黄绿色模块与帕金森病的临床特征显著相关，被选为关键模块（cor = 0.49, p = 0.008, 图2E）。按照 q.weighted < 0.05 的标准，作者选择了 884 个基因进行后续研究。此外，作者还观察到 PD 与黄绿色模块之间的高度相关性（cor = 0.492），而黄绿色模块中的模块成员（MM）与基因重要性（GS）之间的相关性为 0.28（cor = 0.28，p = 2.3e-07，图 2G）。
图2 WGCNA 网络和模块检测
此外，通过 PCA 和不同表达分析，作者得到了 399 个 PD 和 HC 样本之间的 DEGs（图 3A，B）。通过 Venn 图（图 3C），作者筛选出了 15 个与铁突变相关的 WGCNA 基因和 179 个 WGCNA-DEGs。
图3 基因芯片的 PCA 图和不同表达基因的火山图
2.GSEA 和 GSVA
作者进行了 GSEA 和 GSVA 分析，以筛选 PD 和 HC 之间的生物学差异。图 4A、B、C 显示了 GO-BP、GO-CC 和 GO-MF 的富集分析结果。以KEGG和标志基因集为参考集，GSVA富集分析发现PI3K-AKT-mTOR信号通路、活性氧通路、P53信号通路和自噬调控参与了PD的发病机制（图4D, E）。作者还发现一些相关的免疫学通路在 PD 和 HC 之间明显富集（图 4F）。此外，KEGG通路的GSEA分析发现了PD的一些潜在通路，如自噬、细胞凋亡、坏死、NOD样受体信号通路、TNF信号通路、泛素介导的蛋白水解、细胞衰老、有丝分裂、帕金森病、酒精性肝病和中性粒细胞胞外陷阱的形成。
图4 GSVA 不同参考基因集的结果
3.通过机器学习方法筛选出的候选基因
作者使用LASSO逻辑回归算法从15个铁蛋白相关-WGCNA基因中筛选出8个基因作为PD的关键生物标志物（图5A），同时使用RF和SVM-RFE算法筛选候选基因（图5B，C）。通过三种算法得到的重叠基因被认为是候选生物标志物，最终 LPINI 和 TNFAIP3 这两个基因被认为是生物标志物（图 5D）。图 6A, B 显示了对两个特征基因进行 GSEA 分析的 KEGG 通路。LPINI涉及酒精性肝病，TNFAIP3主要与Epstein-Barr病毒感染、麻疹、坏死、NOD样受体信号通路和TNF信号通路有关。为了进一步检验 LPINI 和 TNFAIP3 对 PD 的诊断效果，作者分析了这两个基因的表达水平，并通过 GSE18838 微阵列表达矩阵进行了验证。结果发现，这两个基因在 PD 全血中均呈下调表达，且 ROC 曲线显示这两个基因具有更好的诊断潜力，LPINI 和 TNFAIP3 的 AUC 分别为 0.872（95% CI：0.723-1.000）和 0.818（95% CI：0.647-0.989）（图 6C，D）。此外，还将 GSE72267 作为验证数据集，其中包括 40 例 PD 患者和 20 例健康对照。在 NetworkAnalyst 上建立了 LPIN1 和 TNFAIP3 的 TF-miRNA 核心调控网络（图 6E）。
图5 使用机器学习方法识别与诊断相关的候选基因
图6 候选基因的 KEGG 通路和 GSE18838 数据集的验证
4.GO 和 KEGG 分析
为说明 179 个 WGCNA-DEG 的功能注释，进行了 GO 分析。细胞组成的 GO 分析结果如图 7A 所示。在生物过程类别中，最富集的 GO 术语是线粒体呼吸复合体 I 组装、自噬的正向调节、对活性氧的反应和 T 细胞活化/分化；在分子功能类别中，最富集的 GO 术语是 NADH 脱氢酶（泛醌）活性、MHC 蛋白结合、免疫受体活性和 ATP 代谢过程、Ras 蛋白信号转导、对活性氧的反应和 I-kappaB 激酶/NF-kappaB 信号转导的正向调节等（图 7B，C）。7B, C）。为了研究相关的信号通路，作者进行了 KEGG 和 Reactome 分析。在 Reactome 通路中，大自噬、MHC II 类抗原呈递、脂质代谢、类收费受体级联和细胞对应激的反应参与了 PD（图 7D）。此外，KEGG通路分析还显示，溶酶体、FoxO信号通路、糖尿病心肌病和癌症中的PD-L1表达及PD-1检查点通路可能与帕金森病有关（图7E）。
图7 WGCNA-DEG 的 GO 和 KEGG 通路富集结果
在15个铁死亡-WGCNA基因中，显著富集的GO术语表明，细胞对TOR信号转导的反应、p53类介质的信号转导、选择性自噬、对活性氧或金属离子或氧化应激的反应、脂肪酸代谢过程和神经元死亡与铁死亡和PD相关。KEGG结果表明，mTOR信号通路、细胞衰老、中性粒细胞胞外陷阱形成、神经变性-多种疾病通路、NF-kappa B信号通路等可能在PD中发挥重要作用。
5.浸润免疫细胞的估计和相关分析
首先，作者使用 "CIBERSORT "算法，利用28个样本的基因矩阵估算了22种浸润性免疫细胞的比例。与HC的结果相比，PD样本中幼稚B细胞、浆细胞、幼稚CD4 T细胞、调节性T细胞、巨噬细胞M0和巨噬细胞M1的比例明显降低，而记忆B细胞、γδT细胞和静息树突状细胞的比例明显升高（图8A）。通过矛曼分析发现，候选基因与浸润免疫细胞之间存在正相关和负相关关系。LPINI 与幼稚 B 细胞、浆细胞和幼稚 CD4 T 细胞呈正相关，而与记忆 B 细胞、γ δ T 细胞和静息树突状细胞呈负相关。TNFAIP3 与幼稚 B 细胞、幼稚 CD4 T 细胞、调节性 T 细胞、巨噬细胞 M0 和巨噬细胞 M1 呈正相关，而与γ-δ T 细胞和静息树突状细胞呈负相关（图 8B）。
图8 免疫细胞浸润状况和免疫检查点基因的表达
此外，在T细胞上表达的免疫检查点基因中，TNFRSF18、TNFRSF25、CD28、CTLA-4、ICOS、BTLA、MYLK、CD27、CD226、ADORA2A和CD40L在两组间存在显著差异（图8C）。候选基因与免疫检查点基因的相关性分析见图 8D。LPIN1与上述所有不同的ICG都有明显的相关性，但TNFAIP3仅与TNFRSF18、TNFRSF25、CD28、ICOS、MYLK、CD226、ADORA2A和CD40L有相关性。
6.帕金森病患者和健康对照组的人口统计学和临床特征
健康对照组和帕金森病患者的 RBC、Hb、Hct、单核细胞和淋巴细胞比例有显著差异（P = 0.000、P = 0.000、P = 0.000、P = 0.031）。此外，HC 和早期 PD 患者的白细胞、红细胞、血红蛋白、血色素 Hct 的差异也有统计学意义（P = 0.031、P = 0.000、P = 0.000、P = 0.000）。早期和中晚期 PD 患者的年龄、病程（年）、MDS-UPDRS Ⅲ"关 "评分、白细胞、中性粒细胞（%）、淋巴细胞（%）、中性粒细胞与淋巴细胞比值、单核细胞与淋巴细胞比值也有统计学差异（P = 0.002、P = 0.000、P = 0.000、P = 0.026、P = 0.003、P = 0.001、P = 0.002、P = 0.031）。早期和中晚期帕金森病患者的UPDRS评分有明显差异，这与两期的疾病程度相符。
7.帕金森病患者和健康对照组的 LPIN1 和 TNFAIP3 血浆水平
PD患者LPIN1的血浆浓度（105.7 ng/mL [range 56.98 to 161.3 ng/mL]）明显低于HC患者（121.0 ng/mL [range 87.03 to 773.4 ng/mL]）（p < 0.0001）（图9A）。与HC（20.50 pg/ml [range 5.84 to 159.5 pg/ml]）相比，PD患者的TNFAIP3血浆浓度（45.91 pg/ml [range 4.61 to 193.9 pg/ml]）明显升高（p < 0.0001）（图9B）。当把PD患者分为早期和中晚期时，早期PD患者血浆中LPIN1的水平（101.7 ng/mL [range 77.96 to 137.7 ng/mL]）明显低于HC患者（p < 0.0001），而早期和中晚期PD患者血浆中LPIN1的水平（110.0 ng/mL [range 56.98 to 161.3 ng/mL]）差异无统计学意义（p = 0.2806）（图9C）。与HC相比，早期PD患者的TNFAIP3水平（35.06 pg/mL [range 4.61 to 135.2 pg/mL]）明显升高（p = 0.0407），早期PD患者与中晚期PD患者的TNFAIP3水平（50.63 pg/mL [range 7.75 to 193.9 pg/mL]）也存在明显差异（p = 0.0459）（图9D）。TNFAIP3 与年龄、嗜碱性粒细胞、Hoehn 和 Yahr 量表、疾病分期的相关性较弱。
图9 两种生物标记物的 ELISA 验证
8.浆液性 LPIN1 和 TNFAIP3 在帕金森病中的诊断价值
应用接收者操作特征曲线（ROC）评估了LPIN1和TNFAIP3在PD中的潜在诊断价值。LPIN1和TNFAIP3对PD的ROC曲线下面积（AUC）分别为0.754（95% CI：0.659-0.849，p＜0.0001，敏感性=0.771，特异性=0.692）和0.754（95% CI：0.660-0.849，p＜0.0001，敏感性=0.686，特异性=0.821）（图10A）。在区分早期PD和HC时，LPIN1和TNFAIP3的AUC分别为0.817（95% CI：0.717-0.917，p＜0.0001，灵敏度=0.867，特异性=0.692）和0.650（95% CI：0.507-0.794，p=0.040，灵敏度=0.667，特异性=0.718）（图10B）。然而，LPIN1 和 TNFAIP3 在区分早期和中晚期 PD 患者方面表现不佳（LPIN1：AUC = 0.599，95% CI：0.465-0.733，p = 0.146；TNFAIP3：AUC = 0.647，95% CI：0.510-0.783，p = 0.035）（图 10C）。然后，作者使用逻辑回归分析，结果表明 LPIN1 和 TNFAIP3 的组合预测效果更好（HC vs. PD，AUC = 0.833，95% CI：0.750-0.916，p < 0.0001；HC vs. 早期 PD，AUC = 0.831，95% CI：0.734-0.927，p＜0.0001）（图 10D、E），而对早期和中晚期 PD 的诊断效果相对较差（AUC = 0.637，95% CI：0.505-0.768，p = 0.041）（图 10F）。
图10 两种生物标记物的 ROC
总结
综上所述，作者的研究结果证实，PD血浆中LPINI和TNFAIP3的异常低表达或上调、铁败细胞和循环免疫系统反应与PD的发病机制有关。此外，铁突变相关基因与免疫检查点基因、免疫浸润等也有相关性。因此，该研究进一步加深了人们对嗜铁细胞对外周血单核细胞（主要包括淋巴细胞和单核细胞）影响机制的认识。然而，LPINI和TNFAIP3调控PD中铁死亡和免疫的具体机制尚不清楚。要探索LPINI和TNFAIP3对外周免疫细胞的生物学效应，并为PD提供可靠的临床诊断标志物，还需要更多的研究。
