构建文库

上机测序

根据不同的荧光检测不同的碱基

质量控制（质控QC）

去除低质量的序列

表达定量

统计reads数，进而得到表达矩阵

标准化

让所有样本处在同一起跑线上

主成分分析PCA

图中每个点都代表一个样本，不同颜色表示不同类别，在绿色簇中，出现了一个红色样本，这个样本就是异常样本，需要进行剔除才能进行后续的分析。

差异表达分析与富集分析

找出差异表达显著的基因，对结果进行可视化。

火山图

左侧表示下调的基因，右侧表示上调的基因。横坐标为log2,表示差异的大小。纵坐标为矫正过的P Value值，用来衡量差异的显著性。

经典的热力图和MA图。

热力图中，每一列表示一个样本，顶端显示了分组信息和重复设置。RNA-seq的每个组别一般需要设置2～3个重复，可以减少误差，这是由于RNA分子本身不稳定的性质决定的。

每一行表示一个基因，单元格中颜色深浅表示表达量的高低。

KEGG富集分析和GO富集分析

对差异表达具有显著性的所有基因做一个整体来进行富集分析。
即看看这些基因涉及到了哪些代谢通路或者生物学过程。
也可以对每个具体的通路做进一步分析。

上述所介绍的RNA为mRNA（信使RNA），还有一些非常规的RNA，

RNA-seq分析软件

TopHat and Cufflinks

HISAT, StringTie and Ballgown

原始数据质控及对比

测试数据

下载地址: ftp://ftp.ccb.jhu.edu/pub/RNAseq_protocol/chrX_data.tar.gz

该数据集仅包含了X染色体的数据，方便测试，共12个样本，大约2G左右。

有需要的话还可以下载全染色体数据。

原始数据质控

fastp
下载地址：http://opengene.org/fastp/fastp
GitHub地址：https://github.com/OpenGene/fastp

序列比对

HISTA2

基因表达定量

gtf文件

基因表达定量

String Tie

质量控制

RSeQC

差异表达分析

Read counts矩阵

差异表达分析与富集分析

前期准备

差异表达基因

差异表达作图

富集分析