在当今生物学研究的前沿领域，从探索疾病的发病机制，到新型药物的研发，再到生物工程产品的制造，高纯度、高活性的蛋白质都是不可或缺的基石。
科研人员在蛋白纯化的征程中，时常被诸多难题困扰。一方面，生物样本堪称一个复杂的 “微观宇宙”，里面包含着种类繁多、性质各异的蛋白质，要在这纷繁复杂的环境中精准地分离出目标蛋白，犹如大海捞针。而且，在分离过程中，还要时刻警惕蛋白活性受损，稍有不慎，辛苦表达出来的目标蛋白就可能失去其原本的生物学功能，功亏一篑。另一方面，传统的蛋白纯化方法往往步骤冗长、繁琐，涉及大量精细且耗时的操作，从样本预处理、层析柱选择与平衡，到多轮次的洗涤、洗脱以及后续的浓缩鉴定等，环环相扣，一个环节出问题就可能影响全局，整个实验周期动辄以周甚至月来计算，这无疑极大地耗费了科研人员宝贵的时间与有限的资源。
但现在随着ChatGPT等AI 技术的飞速发展，为我们提供了便利，下面分享利用AI对其进行优化的示例。
先和大家分享一个常规的蛋白纯化 Protocol 示例，希望对理解和应对这些挑战有所帮助。
一、材料准备
细胞裂解液：细胞裂解是释放目标蛋白的首要步骤，而选择合适的裂解缓冲液至关重要。不同的细胞类型，其细胞膜结构、蛋白组成与细胞内环境千差万别，需要针对性地调配裂解缓冲液成分。比如，对于细菌细胞，常用含有溶菌酶、EDTA 等成分的裂解液，破坏细胞壁与细胞膜结构，使蛋白得以释放；对于哺乳动物细胞，可能更侧重于温和的非离子型去污剂，以避免过度破坏细胞内的蛋白复合物。同时，务必添加蛋白酶抑制剂，这就像是给目标蛋白穿上一层 “防护服”，防止在裂解过程中被细胞内源性的蛋白酶降解，确保蛋白的完整性。
亲和层析柱：亲和层析堪称蛋白纯化的 “王牌武器”，其预装的配体能够与目标蛋白发生特异性相互作用，如同精准的 “分子魔术贴”，将目标蛋白牢牢抓住。以常见的 His-tag 为例，与之对应的 Ni-NTA 树脂广泛应用于重组蛋白纯化。当带有 His-tag 的目标蛋白溶液流经 Ni-NTA 树脂柱时，在合适的条件下，蛋白会特异性地结合在树脂上，而非目标蛋白则大多直接流过，从而实现初步分离。
洗涤缓冲液：在目标蛋白结合到亲和层析柱后，柱子上不可避免地还附着有一些非特异性吸附的杂质蛋白，此时洗涤缓冲液就该登场了。其成分依据亲和层析柱的特性而定，通常含有一定浓度的盐类、缓冲物质以及能削弱非特异性相互作用的添加剂。通过用洗涤缓冲液冲洗柱子，就可以逐步洗去这些杂质，让柱子越来越 “纯净”，为后续洗脱目标蛋白做好铺垫。
洗脱缓冲液：这是将目标蛋白从亲和层析柱上 “解救” 下来的关键试剂，通常含有能与目标蛋白竞争性结合柱子配体的物质，最典型的就是咪唑对于 His-tag 和 Ni-NTA 体系。通过调整洗脱缓冲液中竞争性物质的浓度，使得目标蛋白脱离柱子，流入收集管，实现目标蛋白的富集回收。
超滤离心管：经过前面一系列步骤得到的蛋白溶液往往体积较大，且含有多余的盐分、小分子杂质以及可能残留的洗脱试剂等，超滤离心管此时就发挥了浓缩和换液的双重功效。利用其具有特定截留分子量的超滤膜，在离心力作用下，小分子物质可以透过膜被去除，而目标蛋白则被保留在浓缩液中，同时还能将蛋白置换到适合长期储存的缓冲液环境里。
二、实验步骤
细胞裂解：首先，小心翼翼地收集表达目标蛋白的细胞，这一步就如同在果园里挑选成熟的果实，要确保细胞的质量与活性。随后，用预冷的裂解液迅速重悬细胞，将其置于冰上，利用超声破碎仪进行细胞破碎。超声破碎的过程就像是一场微观层面的 “地震”，通过高频声波的震荡，使细胞的细胞膜、细胞壁破裂，蛋白如开闸的洪水般充分释放到溶液中。破碎完成后，立即进行高速离心，将细胞碎片、未破碎的细胞以及一些大分子复合物沉淀到管底，而含有目标蛋白的上清液则被小心地吸取出来，进入下一步骤。
亲和层析：将得到的上清液缓慢加载到提前用平衡缓冲液平衡好的亲和层析柱上，流速控制堪称关键，既不能太快导致目标蛋白来不及充分结合柱子就流失，也不能太慢耽误实验进程。在合适的流速下，目标蛋白与柱子上的配体发生特异性结合，如同精准对接的航天飞船与空间站，而未结合的蛋白则随着流出液排出柱子。收集这些流出液十分必要，后续通过检测其中的蛋白含量，可以判断亲和层析的效果，评估非结合蛋白的情况，为优化实验提供数据支持。
洗涤：用配制好的洗涤缓冲液轻柔地冲洗柱子，这一步需要耐心与细心，多次反复冲洗，确保柱子上的杂质蛋白被尽可能彻底地清除。每一次冲洗后，都要密切监测流出液的蛋白含量，当流出液中的蛋白含量趋近于零时，就表明柱子已经洗涤干净，可以进入洗脱环节了。
洗脱：将洗涤缓冲液更换为洗脱缓冲液，此时，原本紧密结合在柱子上的目标蛋白在洗脱缓冲液的作用下，逐渐脱离柱子的束缚，如同解开了风筝线的风筝，随着洗脱液的流动被洗脱下来。采用分管收集的方式，将含有目标蛋白的洗脱峰分别收集起来，因为不同时间段洗脱下来的蛋白纯度可能存在差异。收集完成后，立即通过 SDS - PAGE 电泳进行初步检测，直观地观察蛋白条带，判断蛋白纯度是否达到预期，若不理想，则需要反思实验过程，寻找优化方向。
超滤浓缩：把洗脱下来的蛋白溶液小心转移至超滤离心管，按照超滤离心管的说明书，精准设置合适的离心力与时间。在离心过程中，溶液中的小分子杂质、多余盐分等透过超滤膜被甩出管外，而目标蛋白则被保留并逐渐浓缩。同时，通过向超滤离心管内添加适量的储存缓冲液，实现蛋白溶液的置换，为蛋白的长期保存创造良好条件。
接下来我们看看怎么利用AI对其进行优化。
第一步：利用 AI 优化亲和层析条件
Prompt：已知目标蛋白是带有 His-tag 的重组蛋白，当前亲和层析使用的是 Ni-NTA 树脂，流速为 1 ml/min，洗涤缓冲液含 20 mM 咪唑，洗脱缓冲液含 250 mM 咪唑，希望提高蛋白纯度并缩短实验时间，优化亲和层析的关键参数，给出具体建议。
行学AI 回答：首先，在洗涤环节，可以大胆尝试逐步提高洗涤缓冲液中的咪唑浓度。从现有的 20 mM 为起点，以 5 mM 的梯度稳步递增至 40 mM。这背后的原理在于，随着咪唑浓度的适度升高，其与柱子上 Ni - NTA 树脂的结合竞争能力逐渐增强，能够更精准、有效地将那些弱结合的杂质蛋白从柱子上 “驱赶” 下来，而目标蛋白由于其 His - tag 与树脂的特异性结合较强，在这一过程中依然能够稳稳地附着在柱子上，不受太大影响，从而显著提升后续洗脱蛋白的纯度。
其次，对于流速这一关键因素，在充分确保柱子压力不超出安全范围的前提下，可以果断将流速从 1 ml/min 提高至 1.5 ml/min。这一调整并非盲目冒进，而是基于柱子的填料特性、耐压能力以及目标蛋白的结合动力学综合考量的结果。适度加快流速，就像是给实验流程按下了 “快进键”，能够在不牺牲蛋白结合效率的基础上，大幅缩短样品在柱子上的处理时间，让整个实验进程更加紧凑高效。
最后，在洗脱阶段，摒弃传统的固定浓度洗脱方式，转而采用线性梯度洗脱策略。具体而言，从 100 mM 咪唑开始，在 10 个柱体积内，让咪唑浓度沿着一条平滑的曲线线性增加至 300 mM 咪唑。相较于直接用 250 mM 固定浓度洗脱，这种动态变化的洗脱方式能够更加细腻地调节目标蛋白与柱子的解离过程。在初始阶段，较低浓度的咪唑能够温和地洗脱那些结合相对较弱的杂质或目标蛋白变体，随着咪唑浓度逐渐升高，真正高纯度的目标蛋白主峰才会被有序洗脱下来，从而获得峰形更尖锐、纯度更高的蛋白洗脱峰，为后续研究提供质量上乘的原料。
第二步：优化超滤浓缩步骤
Prompt：现使用 10 kDa 截留分子量的超滤离心管进行蛋白浓缩，初始蛋白溶液体积为 10 ml，期望最终浓缩至 1 ml 且保证蛋白活性，目前离心力为 3000×g，时间 30 分钟，优化超滤参数。
行学AI 回答：鉴于蛋白活性保护是重中之重，建议当机立断将离心力从 3000×g 降低至 2000×g。较高的离心力虽然在一定程度上能够加快浓缩速度，但如同狂风对娇花的摧残，容易对蛋白的三维结构造成不可逆的损伤，进而导致蛋白活性丧失。而降低离心力后，蛋白在相对温和的环境下进行浓缩，就像是在温室中茁壮成长，能够最大程度地维持其天然活性。
同时，摒弃连续长时间离心的做法，转而采用间歇离心方式。具体操作是，离心 15 分钟后，暂停 5 分钟，让超滤膜有短暂的 “喘息” 机会，恢复其通量性能。这是因为长时间持续的离心压力会使超滤膜逐渐堵塞，降低过滤效率，而适当的间歇能够缓解这一问题，确保超滤过程平稳、高效地持续进行。如此重复 3 次，既能巧妙地避免过高压力对蛋白造成损伤，又能稳稳地确保在较长时间内将蛋白溶液稳定浓缩至目标体积 1 ml。在整个过程中，还要密切关注超滤浓缩的动态变化，通过定期检测浓缩液中的蛋白浓度，依据实际情况适时灵活调整离心参数，确保万无一失。
AI 在蛋白纯化 Protocol 优化中所展现出的巨大潜力，通过向 AI 提出一针见血、针对性极强的问题，科研人员能够依据 AI 给出的专业建议，有的放矢地调整实验关键步骤。如此一来，不仅能够更高效地获得高纯度、高活性的目标蛋白，减少在黑暗中摸索的实验时间，降低珍贵试剂耗材的消耗成本。让 AI 成为实验室里不可或缺的得力助手，携手助力科研突破。
