试剂：CleanAmp™ PCR Kit

仪器：Mastercycler® ep realplex4 S qPCR instrument

品牌：Trilink

国内授权代理：欣博盛生物

分子诊断需求的不断增长（如新冠核酸检测），要求所用检测试剂、设备能在更短的时间内提供准确的、可重复的检测结果。这种需求下，多重实时PCR（Multiplex qPCR）是一项很有用的技术，可省时、省力、省样本，还能降低成本。然而尽管多重qPCR检测技术有着诸多优点，但实际应用时却需要进行很多的优化来避免由于引物组增加而造成的扩增效率下降的问题。Trilink的CleanAmp™ dNTP试剂完美的解决了这一问题，本文展示了使用Trilink的CleanAmp™ dNTP试剂和灵敏的qPCR仪器实现快速三重qPCR的案例。

CleanAmp™ dNTP是Trilink运用自己专业的核酸修饰技术开发的专利产品。

PCR的热启动，通常要通过使用热启动酶来实现。而在PCR实验中，简单的将标准dNTP替换为CleanAmp™ dNTP，即可获得与使用昂贵的热启动酶相同的优势。CleanAmp™ dNTP是经过修饰的核苷三磷酸，该修饰可以在反应初期阻止核苷酸掺入直至dNTP被热激活，如此可极大地减少错误引发，避免引物二聚体形成以及其他可能的不良影响，从而在多重和快速PCR实验中具有非常好的性能。CleanAmp™ PCR Kit试剂盒中提供CleanAmp™ dNTP，并包括已成功验证过的DNA聚合酶。该试剂盒可以灵活地用于多种PCR检测，包括快速和多重PCR。

Eppendorf realplex4 S real-time PCR系统使用超快的珀尔帖（Peltier）热循环模块，可以以6°C /秒的速度加热并以4°C /秒的速度冷却，在一小时内即可完成标准的40循环qPCR反应。珀尔帖模块还可以确保温度控制的精确性以及较高的模块均质性，这对于高质量PCR反应至关重要。该系统的光学模块是一个由96个LED 组成的阵列，这些LED可以预先选择并均衡，以使它们可以均匀的激发所有样本孔。这种设置消除使用其他常规qPCR仪器时，需要用ROX作为校正染料的必要性。Realplex4 S还使用了光电倍增管（PMT）进行信号检测，这是目前可用的最灵敏，最经济的检测技术。

为了进一步探索CleanAmp™ PCR试剂盒和Eppendorf realplex4 S real-time PCR系统的优势，本文的研究以这两种技术的结合为特色，在30分钟内完成可重复性的实时三重PCR的检测。

方法

使用CleanAmp™的dNTP试剂盒与水解探针在realplex4 S real-time PCR系统上进行实时三重PCR检测。使用CleanAmp™ PCR试剂盒扩增了三个小鼠基因组DNA靶标，分别为125、185和214个碱基对。实验分两组进行：首先，分别使用标准和快速PCR对三个靶标同时进行三重扩增（图1）。其次，使用快速PCR对三个靶标进行同时扩增和单个扩增（图2）。所有反应均在带有Master clear™盖条的Eppendorf实时PCR管条中通过使用水解探针进行检测：125 bp（6-JOE; 0.2 µM），185 bp（FAM; 0.05 µM）和214 bp（ROX; 0.2 µM）。

   

首先，对标准和快速循环流程下的三重qPCR实验进行了评估。所有反应均设置一式四份，并使用小鼠基因组DNA的5倍系列稀释液为样本，范围从320 pg至1.0 µg。标准热循环qPCR实验的方案按照CleanAmp™ PCR试剂盒产品说明书中的“多重PCR方案” （1X PCR缓冲液（10 mM Tris-HCl（pH 8.3），50 mM KCl和2.5 mM MgCl2），0.4 mM CleanAmp™ dNTP，0.01 U / µL Taq DNA聚合酶和0.2 µM引物，25 µL）。在快速多重PCR实验方案在上述方案的基础上进行了以下改变：70 mM KCl，4.0 mM MgCl2，0.6 mM CleanAmp™ dNTP，0.33 U /μL U Taq DNA聚合酶，引物（125 bp和185 bp组为0.5 µM，214 bp引物组为0.7 µM）,15 µL)。

其次，在快速循环条件下进一步评估CleanAmp™ dNTP试剂盒，分别以单重和多重反应扩增三个相同的靶标。依然使用小鼠基因组DNA的5倍系列稀释液为样本，范围从320 pg至200 ng，并设置三重复。快速循环条件和热循环条件按照如上所述方案的进行。对于单重反应，遵循CleanAmp™ PCR Kit产品说明书中的“快速热循环方案” （1x PCR缓冲液（10 mM Tris-HCl（pH 8.3），50 mM KCl和4.0 mM MgCl2），0.4 mM CleanAmp ™ dNTPs，0.33 U / µL Taq DNA聚合酶和0.5 µM引物，15 µL体系）。

结果与结论

对比标准和快速两个条件下的三重 qPCR的结果显示：两者分别在1 h 26 min和24 min的热循环时间内得到稳定的数据。在两种反应条件下，扩增曲线间隔良好，重复紧密。R2值显示标准曲线符合良好的线性，且不同靶标、不同检测的扩增效率相当(Figure.1)。同样在快速循环条件下分别进行的单指标和三重指标的扩增结果也类似：对于每个靶浓度，单指标和三重指标的扩增曲线重合，如图2所示。因此，每个反应相似的Cq值反应了不同反应的扩增效率的一致性，如表(图2B)所示。这些发现展示CleanAmp™ PCR试剂盒的多功能性和Mastercycler® ep realplex4 qPCR仪的速度，两者相互补充，仅在24分钟内就能获得高效、可重复的三重qPCR数据。

CleanAmp™ PCR试剂盒和Mastercycler® ep realplex4 S qPCR仪的组合使我们能够在保持与标准PCR或单指标PCR中可得到的高扩增效率的同时，实现快速三重qPCR.