发表单位：瑞士分子健康科学研究所
期 刊 ：Cell Reports（IF:8.8）
发表日期：2023年8月29日
研究技术：ATAC-seq、ChIP-seq 、RNA-seq、scRNA-seq（爱基百客均可以提供）
2023年8月，瑞士分子健康科学研究所的研究团队在Cell Reports期刊(IF=8.8)上发表了题为“FoxM1 coordinates cell division, protein synthesis, and mitochondrial activity in a subsetof b cells during acute metabolic stress”的文章。研究人员通过ATAC-Seq、ChIP-Seq和单细胞RNA-seq等技术，揭示了代谢应激可快速激活FoxM1等关键转录因子，FoxM1通过直接抑制线粒体编码基因，调节蛋白质合成、内质网应激和线粒体活性，从而影响增殖和静止的胰腺β细胞。
01 研究背景
胰腺β细胞是一种长寿的终末分化细胞，对维持葡萄糖稳态至关重要。它们可以通过增加胰岛素的产生、分泌或扩大β细胞质量来适应代谢需求。在严重的代谢应激过程中，β细胞表现出功能受损、胰岛素含量下降、去分化，并最终导致β细胞死亡或增殖。影响β细胞复制的细胞内过程包括胰岛素的产生、β细胞的成熟度、未折叠蛋白反应（UPR）和内质网应激。FoxM1是出生后的关键转录因子，调节出生后β细胞的周转和增殖，在高代谢需求或损伤时维持β细胞的质量，虽然FoxM1在细胞周期进程中已经得到了深入的研究，但对其他功能的研究较少。
本研究中，作者采用成年小鼠β细胞补偿的急性胰岛素抵抗模型，研究染色质重塑和基因表达的时间序列，观察到染色质重组具有显著的早期可塑性，以及控制细胞分裂和蛋白质合成的增殖β细胞（PβCs）的独特转录和功能特征。重要的是，作者发现FoxM1调节蛋白质翻译、内质网应激反应、线粒体生物发生和β细胞活性。
02 研究思路
03 研究结果
⑴. 急性代谢应激诱导β细胞可塑性、内质网应激、蛋白质合成和增殖的变化
为了研究早期代谢应激过程中β细胞功能的时间异质性，作者用PBS或胰岛素受体拮抗剂S961处理小鼠胰岛素1（Ins1）基因启动子控制下表达绿色荧光蛋白（Ins1-GFP）的转基因小鼠24h或72h，诱导高血糖和胰岛素抵抗（图1.A），然后通过流式细胞术分析β细胞粒度，发现在S961给药24小时后，作者观察到两个异质的β细胞亚群：一个高粒度群体（称为S24H），类似于来自PBS对照小鼠（P72H）的β细胞，以及一个较低粒度的新群体（称为S24L）（图1.A），重要的是，S24H细胞在72 h后转化为低粒度的细胞群（图1.A,B）。为了探究粒度的减少是否由于细胞内胰岛素的消耗，作者检测了分选的P72H、S24L、S24H和S72L细胞的胰岛素含量。与PBS相比，S961作用72 h后，S72L细胞中的胰岛素含量明显降低（图1.C），此外，S24L细胞分泌的胰岛素明显少于S24H β细胞（图1.D）。这种异质粒度和胰岛素释放的显著变化显示了不同的分子和功能β细胞亚群。
接下来作者对P72H、S24L、S24H和S72L细胞进行了RNA-seq（图1.E），结果显示，S961处理的β细胞中细胞质、线粒体40S/60S核糖体蛋白（RPs）和真核翻译起始因子（eIF）转录本成分水平的增加（图1.F-I），此外，作者还发现在S961处理诱导了UPR通路相关基因的差异表达（图1.J），并且S72L细胞中涉及“DNA复制”和“细胞周期”以及与胰岛素合成相关的基因转录本的表达增加（图1.K,L）。这些结果表明，在代谢应激过程中，胰岛素分泌下降的早期β细胞首先启动了一个指示细胞周期进入和增殖的转录特征。
图1.早期代谢应激诱导β细胞可塑性、内质网应激、翻译和增殖的变化
⑵. 染色质可及性的变化是对代谢应激的早期反应
为了更好地了解转录调控，作者对转基因Ins1-GFP小鼠的P72H、S24L、S24H和S72L β细胞亚群进行了ATAC-seq，对不同细胞群中差异可及性（DA）位点总数的分析显示，S24L和S72L群体中的DA位点多于P72H和S24H群体（图2.A），大多数可及位点主要发生在靠近TSS的启动子区域（图2.B），而难接近的区域出现在基因间区域或内含子中（图2.C）。接下来作者对RNA-seq和ATAC-seq进行了联合分析，发现在S24H和S24L细胞中“内质网中的蛋白质加工”和“未折叠蛋白质反应”通路富集（图2.D），与UPR反应相关的基因的启动子染色质可及性和RNA转录水平上调（图2.E,F）。在S72L细胞中鉴定出与“细胞周期”、“DNA复制”和“M期途径”通路的富集（图2.G），相关基因的启动子染色质可及性和RNA转录水平上调在S72L细胞表达上调（图2.H,I）。
为了在蛋白水平上证实RNA-seq和ATAC-seq的结果，作者通过在新生蛋白中加入嘌呤霉素来检测蛋白质合成，然后分离小鼠胰岛进行WB，结果显示，与PBS相比，S961处理后24小时内翻译已经增加，而72 h后蛋白质合成速率下降（图2.J），表明24 h后翻译被部分阻断，FACS分选结果显示蛋白质合成的增加主要发生在S24H细胞中（图2.K,L）。WB的结果还显示与UPR反应相关的Hspa5和eIF2a-Ser51磷酸化的蛋白水平在S961处理72h后表达增加，与转录组测序结果一致（图2.J）。ATAC-seq结果显示，S72L细胞中与线粒体功能相关基因的启动子可及性降低（图2.M,N），而且ATP水平在24 h时升高，72 h时下降（图2.O），表明了ATP水平和蛋白质合成速率之间的相关性。这些结果表明应激信号与染色质可及性和转录之间有很强的协调性，在急性代谢应激期间控制着异质β细胞群的蛋白质合成。
图2.染色质可及性的变化是对代谢应激的早期反应
⑶. 不同的转录和功能特征控制着增殖β细胞中的蛋白质合成
之前的研究结果表明，胰岛素分泌、蛋白质合成、线粒体功能和β细胞增殖之间存在时间协调的联系，在S72L细胞中，整体翻译和能量供应下降。为了研究在β细胞异质性的背景下，β细胞增殖对蛋白质合成调控的影响，作者通过对S961处理72h的td-Tomato/Rip-Cre小鼠的β细胞进行分选，然后进行单细胞RNA-seq（scRNA-seq）（图3.A），结果显示，增殖标记物Mki67阳性细胞分布均匀，并不局限于特定的簇（图3.B），说明所有分化的β细胞在S961处理72 h后均具有相同的增殖和分裂潜能。与之前的结果一致，scRNA-seq结果显示PβCs中上调的基因主要富集在“细胞周期”、“DNA复制”和“M期”的途径（图3.C），与增殖标志物Birc5、Nuspa1、FoxM1和Cenpa的表达增加一致（图3.D），下调的基因主要在“翻译”和“内质网中的蛋白质加工”途径中富集（图3.C），与核糖体和ER应激相关基因的表达减少相一致（图3.E,F），此外，参与β细胞功能的基因（Ins2、Chga和Chgb）在PβCs中的表达也减少（图3.G）。
为了进一步探究PβCs的生物学特征，作者从注射了S961或PBS 72h的CcnB1- GFP转基因小鼠中分离出CcnB1-GFP+细胞，然后与td-Tomato/Rip-Cre小鼠的β细胞通过scRNA-seq进行比较（图3.H），作者通过检测增加的CcnB1、Mki67以及有丝分裂和胞质分裂相关的转录本，证实了分选的细胞确实具有增殖能力（图3.I,J），免疫荧光染色显示有丝分裂标记物磷酸化组蛋白3（H3-Ser10）在用S961处理的小鼠胰腺组织切片的β细胞中也增加了（图3.K），接下来，作者检测了增殖的CcnB11细胞中被抑制的基因，发现了与“翻译”和“内质网蛋白质加工”相关的类似富集基因集（图3.L-O），而且β细胞的功能标记物在增殖细胞中受到抑制（图3.P），因此作者推测在有丝分裂和细胞分裂过程中，蛋白质的合成和能量供应可能会减少，作者使用了两种药物处理细胞，Ro3306，CDK1抑制剂，在G2/M过渡阶段阻止细胞周期，PTF-α，P53抑制剂，促进G2/M过渡和细胞分裂（图3.Q），作者发现在Ro3306处理的细胞中，ATP水平和蛋白质合成增加，而PTF-α处理的β细胞则引起了相反的反应（图3.R,S），单细胞的ATP水平在G1期逐渐增加，G2期达到最高水平，细胞分裂后急剧下降（图3.T,U）。这些结果揭示了在有丝分裂过程中，PβCs的ATP水平和蛋白质合成的降低。
图3.不同的转录和功能特征控制着增殖β细胞中的蛋白质合成
⑷. FoxM1调节蛋白质合成和ER应激反应
为了确定在β细胞增殖和代谢应激过程中可能作为内质网应激、蛋白质合成和增殖的主调控因子的特定转录因子，作者对整体和单细胞的RNA-seq数据进行了ChEA分析，发现FoxM1是最丰富的转录因子（图4.A），s961处理的小鼠胰岛中FoxM1蛋白水平显著上调（图4.B,C），WB分析嘌呤霉素标记的胰岛显示，过表达FoxM1时，胰岛中的蛋白合成减少（图4.D），另外FoxM1沉默时，蛋白质合成增加（图4.E），这些结果表明，FoxM1可以调节β细胞中的蛋白质合成。TG处理的FoxM1沉默的Min6细胞显示eIF2a-Ser51磷酸化水平升高，Caspasase-3水平升高，表明凋亡率更高（图4.F），而过表达FoxM1具有保护作用（图4.G），表明β细胞中FoxM1的激活是缓解内质网应激所必需的。
为了进一步探究FoxM1、内质网应激与蛋白质合成之间的联系，接下来作者对过表达FoxM1或GFP的小鼠的胰岛进行了RNA-seq，结果显示，FoxM1过表达后DNA复制基因增加（图4.H），而与β细胞功能有关的基因仅轻微降低（图4.I），与内质网应激相关的基因表达降低（图4.J），线粒体转录本水平降低（图4.K,L），13个ATP合酶转录本（图4.M）和16个NADH：泛素氧化还原酶复合物（图4N）表达下调，这些发现揭示了FoxM1水平与线粒体基因表达之间广泛的反向关系。为了探究FoxM1除了调控核基因外，是否也转录控制线粒体编码基因，作者通过免疫荧光分析发现，GFP-FoxM1蛋白定位于线粒体、细胞质和细胞核（图4.O），WB的结果显示内源性的FoxM1在线粒体中高表达（图4.P）。
图4.FoxM1调节蛋白质合成和ER应激反应
⑸. FoxM1调控线粒体编码基因的转录，控制线粒体的生物发生和功能
为了探究FoxM1在线粒体代谢中的作用，作者检测了过表达FoxM1时β细胞中的耗氧量，结果显示耗氧量下降（图5.A,B），ATP水平也有所降低（图5.C,D），在FoxM1沉默的细胞中，ATP水平升高（图5.E）。而且FoxM1的过表达降低了线粒体DNA的拷贝数，沉默FoxM1后线粒体DNA的拷贝数又增加（图5.F,G）。WB的结果显示，FoxM1过表达时，Min6细胞中线粒体和胞质部分的翻译率都有所下降（图5.H-J）。为了更好地理解FoxM1如何调节翻译的机制，作者在Min6细胞中过表达V5标签标记的FoxM1，然后进行ChIP-seq，作者发现FOXM1广泛而不均匀地结合在整个线粒体基因组的正向和反向链上（图5.K）。另外作者通过与人类β细胞的scRNA-seq数据对比，发现在表达FoxM1的β细胞中，有59个基因显著下调，其中7个是线粒体编码基因（图5.L），GO分析显示下调的基因主要富集在与线粒体功能相关的通路（图5.M）。这些数据表明FoxM1可以调控线粒体编码基因的转录，控制线粒体的生物发生和功能。
图5.FoxM1调控线粒体编码基因的转录，控制线粒体的生物发生和功能
04 研究结论
在本研究中，作者通过ATAC-seq、RNA-seq、scRNA-seq以及ChIP-seq等表观遗传技术，揭示了β细胞对早期代谢应激的反应特征，证明了一个UPR反应激活、蛋白质合成减少的β细胞亚群，其在胰岛素消耗后更容易增殖，通过β细胞的异质性反应来增加胰岛素分泌和刺激有丝分裂后的细胞分裂。此外，作者还发现代谢应激可快速激活FoxM1等关键转录因子，FoxM1通过直接抑制线粒体编码基因，调节蛋白质合成、内质网应激和线粒体活性，从而影响增殖和静止的β细胞。因此，增强FoxM1活性可能是维持β细胞功能的一种很有前途的治疗策略。
原文链接：
https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(23)00997-X
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