今天给同学们分享一篇单细胞+预后模型的生信文章“Integrating single-cell and bulk RNA sequencing to predict prognosis and immunotherapy response in prostate cancer”，这篇文章于2023年9月20日发表在Scientific Reports期刊上，影响因子为4.6。
前列腺癌（PCa）主要是一种发生在前列腺腺体的上皮恶性肿瘤，是全球男性最常见的癌症之一。尽管PCa的原因尚不清楚，但研究表明年龄、家族史、种族和基因调控等因素都与其发展有关。
1. CAF的识别
该研究的工作流程总结如图1所示。作者对scRNA-seq数据进行了细胞周期效应去除、归一化、降维和聚类分析，tSNE图显示了不同聚类的分布情况（图2A）。气泡图显示了每个聚类中标记基因的表达水平（图2B），作者对这些聚类进行了细胞注释（图2C）。作者提取了成纤维细胞并对其进行了上述分析，tSNE图显示了四个聚类的分布情况（图2D）。作者使用"FindAllMarkers"函数对每个聚类中高变异基因（logFC >= 0.5，min.pct = 0.3和diff.pct >= 0.2）进行了筛选，共鉴定出463个CAFRGs。最后，富集分析显示，聚类0主要涉及动脉形态发生、一氧化氮介导的信号转导、Rho蛋白信号转导的调节、PI3K-Akt信号通路和细胞外基质-受体相互作用；聚类1主要富集于肌肉系统过程、肌肉收缩、肌细胞分化、血管平滑肌收缩和cGMP-PKG信号通路；聚类2主要富集于细胞外基质组织、细胞外结构组织、外部包囊结构组织、补体和凝血级联反应以及金黄色葡萄球菌感染；聚类3主要富集于凋亡信号通路的调节、内源性凋亡信号通路、节律过程、细胞衰老和肌萎缩性侧索硬化症（图2E和F）。
图1 整体工作流程
图2
2. 预测模型的构建
作者根据7:3的比例随机将整个PCa样本集分成训练集和测试集；训练集包含522个PCa样本，测试集包含220个PCa样本。单变量Cox分析筛选出29个预后相关的CAFRGs（图3A），LASSO分析进一步筛选出18个候选CAFRGs（图3B），多变量Cox分析构建了一个包含10个预后相关CAFRGs的模型（图3C）。
图3
3. 预后标志的验证
图4A显示，低风险组的前列腺癌患者生存率在不同的内部数据集（训练集、测试集、整体集、TCGA和GSE116918数据集）中显著较高，并且差异具有统计学意义，表明模型在内部的稳定性较高。图4B显示，高风险组的前列腺癌患者在不同的外部数据组（GSE46602、GSE70769和GSE116918数据集）中更有可能出现较高的BCR，并且差异具有统计学意义，表明该模型能够预测前列腺癌患者的预后和BCR。所有的曲线下面积（AUC）值都高于0.8，并且大于临床特征的AUC值（图5）。该模型是预测前列腺癌患者预后的独立预测因子（图6A）。为了更好地将该模型应用于临床工作，作者构建了一个结合了模型和临床特征的示意图，用于预测前列腺癌患者3年、5年和7年的生存概率，表明高风险组或低风险组对预后影响最大（图6B）。
图4
图5 所有标识的AUC值都高于0.8，并且大于临床特征的AUC值
图6
4. 富集分析和突变分析
在|logFC > 1|和FDR < 0.05的阈值下，作者发现了183个差异表达基因（DEGs）。作者采用GO和KEGG分析来探索这些DEGs在前列腺癌中的作用和分子通路。生物过程（BP）术语与有丝分裂核分裂（GO:0140014）、姐妹染色单体分离（GO:0000819）和有丝分裂姐妹染色单体分离（GO:0000070）相关；细胞组分（CC）术语与肌节（GO:0030017）、肌原纤维（GO:0030016）和收缩纤维（GO:0043292）相关；分子功能（MF）术语与受体配体活性（GO:0048018）、信号受体激活活性（GO:0,030,546）和CXCR趋化因子受体结合（GO:0045236）相关（图7A）。KEGG分析显示，DEGs在IL-17信号通路（hsa04657）、阿米巴病（hsa05146）、ECM-受体相互作用（hsa04512）、类风湿性关节炎（hsa05323）、金黄色葡萄球菌感染（hsa05150）和病毒蛋白与细胞因子及细胞因子受体相互作用（hsa04061）中富集（图7B）。图7C和D显示了不同风险组中的基因突变情况，表明高风险组的突变数量明显多于低风险组，这可能与高风险组的预后不良有关。
图7
5. 免疫微环境和免疫疗法
图8A显示，大多数免疫细胞浸润水平在低风险组中较高。图8B显示，除了促炎、主要组织相容性复合体I类和T细胞共刺激外，低风险组的免疫功能评分较高。CD274、LAG3和PDCD1等ICG的表达在不同风险组之间也有差异（图8C）。理论上，TMB评分越高，T细胞能够识别的新抗原越多，因此免疫治疗效果越好。高风险组的TMB评分较高，表明高风险组的患者更适合免疫治疗（图8D）。而TMB评分与风险评分的结合也是患者预后的强有力预测指标（图8E和F）。
图8
6. 为不同风险群体的患者寻找抗肿瘤药物
除了免疫疗法外，化疗和靶向治疗也是前列腺癌治疗的主要策略。在本研究中，作者使用R软件包“pRRophetic”计算了不同组的IC50，并最终筛选出了31种化疗药物和靶向治疗药物（p < 0.001；图9）。
图9
总结
在这里，作者分析了前列腺癌（PCa）单细胞测序数据中的肿瘤相关成纤维细胞（CAFs），将它们分为四个聚类，并鉴定了CAFRGs。作者还基于CAFRGs构建了一个前列腺癌预后的诊断图，用于预测患者的预后和免疫治疗反应。总之，作者的研究将为前列腺癌的靶向治疗提供新的临床视角，并更好地预测患者的预后结果。
